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研究背景三氯乙烯(Trichloroehtylene,TCE)是一种广泛应用于工业生产的高分子有机化合物,其主要用途是在工厂中作为金属、电子元件的清洗剂和脱脂剂等。随着TCE接触人群的不断增加,以及近几年工业生产中对TCE的使用不合理,以及对其管理不当,使得TCE已经严重污染了生活的环境,例如空气污染、饮用水污染和土壤污染等,TCE已经成为国内外危害严重的职业毒物和环境污染物。职业性三氯乙烯暴露能够导致职业性三氯乙烯药疹样皮炎(Occupational Dermatitis Medicamentosa-like of Trichloroethylene,ODMLT),现今大多认为ODMLT是一种由T淋巴细胞介导的迟发型变态反应,但是其损伤机制不能单一的用TCE致敏性来解释。与其他化学致敏物相比,TCE引起的机体免疫反应更为强烈,提示TCE在具有致敏性之外,还具有免疫毒性。Th1/Th2/Th17/Treg平衡是机体内免疫内环境稳定的重要平衡,能够有效地调节免疫防御反应,与免疫性疾病关系密切。研究目的本研究通过对不同组别以及时点TCE染毒小鼠脾脏中Th1,Th2,Th17和Treg细胞比例,各自特异性表达的转录因子(T-bet、GTAT-3、ROR-γt、Foxp3)及分泌的细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10),探讨TCE暴露对小鼠Th1/Th2/Th17/Treg细胞平衡的影响,研究三氯乙烯药疹样皮炎的免疫机制。研究方法选取6-8周清洁级健康BALB/c雌性小鼠100只,水食充足,饲养一周时间,然后随机分为:空白对照组、溶剂对照组、TCE低剂量组和TCE高剂量组。采用饮水暴露的方法,空白对照组不作任何处理,溶剂对照组喂以1%二甲基亚砜(DMSO),TCE低剂量组与TCE高剂量的浓度分别为2.5mg/ml和5.0mg/ml(TCE用1%DMSO助溶)。TCE染毒后,分别在2、4、8、12、16周五个时点处死小鼠,收集小鼠全血,无菌取小鼠脾脏组织。采用流式细胞术检测各组小鼠脾脏中Th1、Th2、Th17和Treg细胞比例。采用免疫组化的方法检测各组小鼠脾脏中IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10细胞因子的表达。采用荧光定量PCR检测细胞特异性核转录因子T-bet、GTAT-3、ROR-γt和Foxp3 m RNA表达水平。采用ELISA法检测各组小鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10的含量。结果1.小鼠脏器系数结果在整个实验过程中,小鼠状态良好,未出现染毒死亡状态。脏器系数结果显示:溶剂对照组与空白对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。与溶剂对照组相比,TCE低剂量组小鼠的脏器系数无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。TCE高剂量组中,2、12、16周时,脾脏系数无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);而在4W与8W时,小鼠的脾脏系数显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.脾脏组织中细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10的表达情况检测小鼠小鼠脾脏中IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10细胞因子的表达,免疫组化结果显示:与空白对照组相比,溶剂对照组中各细胞因子表达水平无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。在TCE低剂量组中,在4、8、12周时,IFN-γ和IL-4的表达水平显著升高,IL-10的表达水平显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);而IL-17在各时间点均呈显著升高趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。在TCE高剂量组中,IFN-γ在4、8、12周时表达水平显著升高,IL-4在2、4、8、12周时表达水平明显增高,而IL-17与IL-10的表达水平在各时点均显著变化,IL-17显著升高而IL-10显著下降,差异均具有统计学意义(P<0.05),并且其改变趋势较TCE低剂量组更为明显。3.脾脏组织中Th1、Th2、Th17和Treg细胞比例结果用流式细胞术检测小鼠脾脏Th1、Th2、Th17和Treg细胞比例,结果显示:溶剂对照组与空白对照组相比,各细胞比例无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。在TCE低剂量组中,Th1、Th2、Th17和Treg细胞比例于溶剂对照组相比均发生了显著改变,其中Th2和Th17细胞比例显著上升,差异具有统计学差异(P<0.05);Th1细胞在2、4、8、12周时,比例均出现明显上升情况,差异具有统计学意义(P<0.05);Treg细胞比例显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。在TCE高剂量组中,各细胞比例的也发生了显著改变,而且改变趋势较低剂量组更为明显,Th1、Th2和Th17细胞比例在个时间点均呈上升趋势,差异具有统计学意义(P<0.05),Treg细胞比例在各时间点均显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.脾脏组织中Th1/Th2/Th17/Treg平衡改变结果Th1/Th2/Th17/Treg细胞平衡的结果显示:与空白对照组相比,溶剂对照组无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。TCE处理组与溶剂对照组相比,Th1/Th2比例明显下降而Th17/Treg比例明显上升,差异具有统计学意义(P<0.05),且高剂量组比低剂量组的改变趋势更为明显。5.脾脏组织中核转录因子T-bet、GTAT-3、ROR-γt和Foxp3 m RNA表达水平荧光定量PCR结果显示:溶剂对照组中的各核转录因子的表达水平与空白对照组相比无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。在TCE低剂量组中,T-bet和ROR-γt分别在4、8、12周时表达水平有显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);GATA-3在2、4、8、12周时的表达水平有明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05);而在8、12周时,Foxp3的表达水平明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。在TCE高剂量组中,T-bet的表达水平与低剂量组相同,在4、8、12周时显著上升,差异具有统计学意义(P<0.05);GATA-3在各时间点的表达水平有明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05);ROR-γt和Foxp3在4、8、12、16周时的表达水平均有显著改变,ROR-γt显著升高而Foxp3显著下降,差异均具有统计学意义(P<0.05)。6.脾脏组织中T-bet/GTAT-3/ROR-γt/Foxp3比例的结果结果显示:与空白对照组相比,溶剂对照组中T-bet/GTAT-3与ROR-γt/Foxp3无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。TCE处理组与溶剂对照组相比,T-bet/GTAT-3比例在中各时间点均显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);ROR-γt/Foxp3比例在4、8、12、16周时均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05),并且其下降的趋势在TCE高剂量组中更为明显。结论1、TCE具有免疫毒性,通过染毒后能够改变小鼠免疫脏器中Th1、Th2、Th17和Treg细胞的数量比例。2、染毒过程中TCE引起小鼠体内Th1/Th2/Th17/Treg细胞失衡,其可能在TCE引起的免疫性损伤中发挥重要作用。