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背景:糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病的主要的微血管并发症,并成为导致慢性肾脏病及终末期肾病的首要原因。肾脏纤维化是包括DKD在内的慢性肾脏病的最终病理机制,表现为:肾小球硬化,肾小管萎缩,肾间质纤维化。尽管肾小球病变在DKD中具有无可争辩的重要性和意义,但糖尿病肾小管损伤也是DKD病理的重要组成部分,并且是糖尿病肾脏预后的主要决定因素。有针对性地发现和治疗早期肾小管损伤可能达到预防或延迟糖尿病肾病的作用。哺乳动物全基因组和转录组研究数据显示,蛋白编码基因在基因组中只占非常小的比例(1%-2%),而基因组中的大部分基因编码大量远远超过我们预期的非编码RNA。长链非编码RNA(IncRNA)是一类转录本长度大于200个核苷酸的RNA分子的总称,不编码蛋白质,而是以RNA的形式参与多种重要的生物学过程。LncRNA GAS5(The growth arrest-specific 5)在细胞停滞、增殖、凋亡、自噬等许多生物过程中扮演着重要角色。在糖尿病人群及小鼠血浆中GAS5存在差异性表达,并且GAS5在TGFβ-SMAD通路中起到作用。而TGFβ1通路在糖尿病肾病的发生和发展中至关重要。目前有研究发现GAS5在肝脏及心肌纤维化起到抑制作用,但是在肾间质纤维化及糖尿病肾病机制中并无研究。本课题研究了在糖尿病肾病对GAS5表达的影响,GAS5对肾小管上皮细胞促纤维化基因的作用,并对其潜在的机制进行探讨。旨在通过调节GAS5表达为糖尿病肾病治疗提供可能的新方法。方法:1、选取HFD/STZ诱导C57BL/6J小鼠造糖尿病模型,同系正常小鼠作为对照。HE染色和Masson染色检测12周龄小鼠肾脏的病理变化。免疫组化检测小鼠肾组织 TGFβ1,COL1,CTGF,FN1。RT-qPCR 及原位杂交(ISH)检测 Gas5在DKD小鼠中的差异性表达。2、TGFβ1 刺激 HK-2 细胞 48 小时,RT-qPCR 和 Western Blot 检测 COL1,CTGF,FN1表达。RT-qPCR检测GAS5在肾小管上皮细胞模型中的差异性表达。3、TGFβ1 刺激 HK-2 细胞,转染 siGAS5,RT-qPCR和Western Blot 检测GAS5,COL1,CTGF,FN1 的 mRNA和蛋白的表达。4、HK-2细胞核质分离后检测GAS5和miR-96-5P在胞质和胞核中的表达情况。生物信息学网站筛选与GAS5结合的microRNA。SiGAS5处理HK-2细胞48小时,RT-qPCR检测筛选目标microRNA,锁定miR-96-5p。RIP实验验证GAS5和miR-96-5p存在结合关系,双荧光素酶报告基因验证二者的直接结合位点。HK-2细胞瞬时转染miR-96-5P mimic/inhibitors 48小时后,提取细胞总RNA,检测GAS5相对表达量。5、TGF-β1 刺激 HK-2 细胞,分别转染 miR-96-5p mimics/inhibitor 或其阴性对照,RT-qPCR和Western Blot检测COL1,FN1,CTGF的mRNA和蛋白的表达。生物信息学网站预测miR-96-5p靶向调节FN1,双荧光素酶报告基因验证二者的直接结合位点。结果1、建模12周HFD/STZ诱导C57BL/6J小鼠肾组织已经呈现DKD肾纤维化的病理特征,免疫组化显示TGF-β1,COL1,CTGF,FN1表达增加,RT-qPCR及ISH检测均提示GAS5表达较对照组明显增加。2、TGFβ1刺激HK-2细胞48小时后,促纤维化基因COL1,CTGF,FN1的mRNA和蛋白的表达水平显著上调。GAS5表达明显增加。3、TGFβ1 刺激 HK-2 细胞,转染 siGAS5 后,RT-qPCR 和 Western Blot 检测COL1,FN1,CTGF的mRNA和蛋白的表达明显受抑制。4、HK-2细胞核质分离后检测GAS5在主要在胞浆中表达,生物信息学预测初步锁定了 5个miRNAs。siGAS5处理HK-2细胞48小时后miR-96-5p mRNA表达明显上调。RIP实验验证GAS5和miR-96-5p可能通过AGO2存在结合关系,双荧光素酶报告基因验证二者的直接结合位点。GAS5相对表达量在瞬时转染miR-96-5P mimic组减少;而瞬时转染miR-96-5Pinhibitors组却增加。5、TGFβ1 刺激 HK-2 细胞,转染 miR-96-5p mimics后COL1,CTGF,FN1 的mRNA 和蛋白的表达下调;转染miR-96-5p inhibitor,RT-qPCR 和 Western Blot检测COL1,CTGF,FN1的mRNA和蛋白的表达明显上调。生物信息学网站预测miR-96-5p靶向调节FN1,双荧光素酶报告基因验证二者的直接结合位点。结论:1、糖尿病时肾组织lncRNA GAS5表达增高,促进肾小管间质纤维化。2、在人肾小管上皮细胞中GAS5通过吸附miR-96-5P,减少miR-96-5P对靶基因FN1的抑制作用,发挥促进纤维化的作用。