lncPvt1调控自噬在同型半胱氨酸致小鼠足细胞损伤的机制研究

来源 :宁夏医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:pinxue
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目的观察同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)对lncRNA Pvt1(lncPvt1)表达的影响,明确lncPvt1对自噬水平是否有调控作用,确定自噬水平的改变对足细胞损伤的影响,阐明lncPvt1调控自噬水平变化促进同型半胱氨酸致肾小球足细胞损伤的机制。方法动物模型的复制:实验采用9只野生型雄性C57BL/6J小鼠(Cbs+/+)为对照组;9只以C57BL/6J背景的胱硫醚β合酶基因敲除杂合子(Cbs+/-)雄性小鼠为模型组。两组同时给予高蛋氨酸饲料,连续饲养4周。采用PAS染色观察各组肾小球形态,统计PAS染色阳性面积与肾小球总面积比值,透射电镜观察两组小鼠肾小球足细胞损伤和自噬小体变化情况,Western blot检测肾皮质中足细胞标记蛋白Nephrin,Podocin和自噬相关蛋白LC3,P62的表达,免疫荧光染色观察肾小球中LC3和p62的表达。qRT-PCR检测肾皮质中lncPvt1的表达,荧光原位杂交(FISH)观察lncPvt1在肾小球的表达。体外细胞模型复制,采用不同Hcy浓度(0μmmol/L、20μmmol/L、40μmmol/L、60μmmol/L、80μmmol/L、100μmmol/L)刺激足细胞12h、24h、48h,筛选足细胞自噬水平升高最明显的的浓度和时间(实验结果显示为80μmmol/L,24小时)。根据筛选结果将足细胞分为2组:Control组(0μmmol/L Hcy处理24小时),Hcy组(80μmmol/L Hcy处理24小时),qRT-PCR、FISH检测足细胞中lncPvt1的表达和核质分布;采用mRFP-GFP-LC3腺病毒转染足细胞后使用自噬抑制剂抑制Hcy干预的肾小球足细胞,观察自噬流的变化;同时,构建lncPvt1过表达/干扰载体并转染足细胞,qRT-PCR验证其自身lncPvt1的表达,Western blot、免疫荧光检测Hcy干预后自噬相关蛋白LC3和p62的表达。结果1.PAS染色观察肾小球形态,统计PAS染色阳性面积与肾小球总面积比值:与Cbs+/+组相比,Cbs+/-组肾小球系膜细胞增生和系膜基质的增多,系膜区增宽,PAS染色阳性面积与肾小球总面积比值升高(P<0.05)。2.Western blot检测Nephrin和Podocin蛋白的表达,结果显示:与Cbs+/+组相比,Cbs+/-组Nephrin和Podocin蛋白表达均降低(P<0.05)。3.透射电镜观察肾小球足细胞:与Cbs+/+组相比,Cbs+/-组损伤明显,自噬水平升高。4.Western blot和免疫荧光检测肾皮质中LC3和p62蛋白表达,结果显示:与Cbs+/+组相比,Cbs+/-组LC3II/I升高(P<0.05),p62/β-actin降低(P<0.05),免疫荧光结果与Western blot结果一致。5.筛选足细胞自噬升高最显著的Hcy作用浓度和时间,结果显示:与0μmol/L 24h组相比,80μmol/L 24h组LC3II/I值升高最显著(P<0.05),p62/β-actin下降最显著(P<0.05)。6.自噬流检测显示:与Control组相比,Hcy组自噬水平增加;与Hcy组相比,Hcy+3MA组自噬水平下降。7.qRT-PCR检测肾皮质lncPvt1表达,结果显示:与Cbs+/+组相比,Cbs+/-组lncPvt1表达升高(P<0.05);与Control组相比,Hcy组lncPvt1表达明显增高(P<0.05);FISH图检测肾小球lncPvt1表达:与Cbs+/+组相比,Cbs+/-组肾小球lncPvt1的表达升高。8.qRT-PCR和FISH检测Hcy组lncPvt1的核质表达分布,结果显示:lncPvt1在细胞质和细胞核均有分布。9.构建lncPvt1过表达/干扰载体并转染足细胞,qRT-PCR验证转染后足细胞lncPvt1的表达:与Lv-GFP组相比,Lv-Pvt1组lncPvt1的表达量升高(P<0.05);与ASO-NC组相比,ASO-Pvt1组lncPvt1的表达量降低(P<0.05)。10.Hcy干预各组足细胞后Western blot、免疫荧光检测LC3和p62蛋白,结果显示:与Lv-GFP+Hcy组相比,Lv-Pvt1+Hcy组LC3II/I升高(P<0.05),p62/β-actin降低(P<0.05);与ASO-NC+Hcy组相比,ASO-Pvt1+Hcy组LC3II/I降低(P<0.05),p62/β-actin升高(P<0.05)。免疫荧光结果与Western blot结果一致。结论Hcy通过上调lncPvt1的表达导致肾小球足细胞自噬水平升高可能是Hcy致肾小球足细胞损伤的机制之一。
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