近年来,微流控芯片上的数字PCR方法得到了长足的发展。数字PCR技术以其超高的灵敏度、准确度和绝对定量的性质也引起人们的强烈关注。数字PCR技术与微流控芯片相得益彰,互相促进,如集成流路数字PCR芯片、滑动芯片、百万像素数字PCR芯片和多种液滴数字PCR芯片。然而,这些现有的数字PCR芯片或者配有较多的管路或者配有复杂的外加设备,操作费时费力。并且,现有的几款已经商业化的数字PCR仪器价格昂贵,并且完全依赖进口,限制了数字PCR技术在我国生命科学研究领域的普及。另外,微流控芯片的集成化是一大的发展趋势,将样品处理、富集、分离纯化、反应等功能元件通过某种方式集成到一张芯片上,使其协同发生作用,力求实现真正的sample-in/answer-out。本文在总结了数字PCR技术的原理、发展和应用的基础上,结合了本实验室的实际情况,取得了如下的创新结果：1)、利用PDMS的透气性并结合了滤器的过滤原理,我们设计并研制了一种基于PDMS透气性的薄膜数字PCR芯片。该芯片包括如同滤器结构的μfilter结构和如同滤膜的薄膜芯片。其中的μfilter结构有两部分组成,其上有进样孔和抽气孔,能实现一端抽气,一端进样。薄膜芯片如同滤膜被夹于μfilter中间,其上有650个直径0.2 mm,深0.23 mm的圆形小室。当连接μfilter的注射器抽动时,薄膜芯片的一侧出现了低于大气压的负压,被样品封闭的空气会慢慢透过PDMS薄膜进入到注射器中,最终将液体试剂带入到每个小室中并充满。充满样品的薄膜芯片可以在PCR仪上进行数字PCR反应。2)、PDMS的透气性虽然方便了进样,但在PCR的反应热循环中也引起了水分的蒸发,影响了反应。我们没有进行特殊处理,而是在薄膜芯片外增加一片面积较大的补水层,抑制了蒸发带来的危害,取得了很好的效果。3)、我们通过分步进样的方法,将核酸提取元件与数字PCR元件集成起来。首先将核酸提取的所需的试剂分段存放在特氟龙管中,当我们在核酸提取元件的一端抽动注射器时,特氟龙管的试剂依次经过核酸提取区,样品裂解液中的磁珠被核酸提取区的磁铁吸附下来,洗涤试剂依次通过核酸提取区完成对磁珠的清洗,PCR试剂将纯化核酸从磁珠上洗脱下来。由于负压操作,核酸提取中的样品裂解液和洗涤液无法进入到PCR反应区中,防止了污染的发生。4)、我们发展了基于PDMS透气性的进样方法,在微流控芯片的数字PCR小室旁放置一个面积较大的抽气层实现负压进样。当连接抽气层的注射器抽动的时候,抽气层内部呈现负压,芯片小室中的气体透过PDMS进入到抽气层中,并将试剂带入并充满每个小室。同时,抽气层待进完样之后,又被充入水分起到了防蒸发的作用。我们同时将核酸提取元件集成到此数字PCR芯片上,实现了在一张芯片上进行核酸提取和数字PCR反应。综上所述,基于PDMS的透气性,我们研制了一种可以利用注射器提供的负压就能实现样品进样,并能完成数字PCR反应的微流控芯片。该数字PCR系统比现有的数字PCR平台更加简便、易操作、实用性好。我们还通过分步进样的方法实现了核酸提取元件与数字PCR反应元件在微流控芯片上的集成,并成功的进行了牛肉DNA的提取和数字PCR检测。其特点是操作方便快速、试剂消耗少,准确性好,适于普通实验室使用。并且该芯片还可利用到基于磁珠方法的RNA提取,细胞捕获等方面,为生命科学领域的更关键问题如肿瘤诊断、单细胞检测、稀有细胞捕获和检测提供了一种新的方法和仪器。