水稻卷叶基因NRL的克隆与功能验证

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水稻叶片在植物的光合作用、呼吸作用及蒸腾作用中发挥重要作用,而叶型更是育种中重要的农艺性状。叶的适度卷曲及直立能够提高水稻的光合作用效率和抗逆性,从而提高水稻的产量。因此水稻叶卷曲直立的相关基因克隆及功能解析,对于提高水稻产量及遗传育种具有重大意义。  利用化学诱变剂甲基亚硝基脲(MNU)处理水稻粳稻品种T65,获得了叶片直立卷曲的突变体EM1317,该突变体表型为叶片变窄且向内卷曲。徒手切片发现叶片总维管束数目减少。进一步的石蜡切片观察发现:与野生型相比,突变体叶主脉、叶鞘和叶枕中的维管束数目减少,叶片中泡状细胞面积减小及厚壁细胞发育缺失且被叶肉细胞取代。  通过图位克隆方法分离得到narrow and rolled leaf(NRL)基因,该基因编码黄素单加氧酶YUCCA家族成员OsYUCCA8,参与植物生长素IAA的合成。序列分析结果发现该突变基因ORF区域中一个碱基C到T的突变引起了OsYUCCA8保守结构域ATGY的变化,导致表型的突变。互补和抑制表达实验证实NPL(OsYUCCA8)就是目标基因。  qPCR结果表明OsYUCCA8在根、茎、叶、叶枕、叶鞘、穗和种子中均有表达,且在叶片中表达量相对其他组织较高。同时OsYUCCA8基因启动子驱动GUS染色表明,该基因在各种组织中均表达且在叶片中表达量较高。水稻原生质体瞬时转化结果表明OsYUCCA8定位于内质网。  通过测定IAA含量发现,EM1317叶片中IAA含量明显低于野生型T65,同时转化DR5∷GUS获得转基因植株,GUS染色发现生长素分布也发生了变化。突变体对IAA敏感性增强,对乙烯前体ACC和生长素转运抑制剂NPA不敏感。在水稻中抑制表达OsYUCCA8,转基因愈伤中IAA含量降低了约40%,再生植株的叶片表型与突变体相似。过量表达该基因,愈伤中IAA的含量提高了约90%,叶片横切发现泡状细胞数目增多且厚壁细胞发育正常。将ATGY保守结构域中的TGY分别突变即构建含AAGY、ATAY和ATGA的恢复表达载体,并进行遗传转化,获得的转基因植株,叶片表型均没有得到恢复。结果表明OsYUCCA8的ATGY保守结构域中的氨基酸对其酶活性都起关键作用,均影响IAA的合成。  本研究检测了与生长素和叶片发育相关基因的表达量发现,PIN、 ARF14和ExpansionA的表达量下降比较明显,而其它基因表达量变化不明显。
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