[研究背景]脓毒症是宿主对感染的反应失调而致的危及生命的器官功能障碍。心脏是最易受损的器官之一,约40%-60%的脓毒症患者伴有心肌损伤,其病死率为70%-90%,而无心肌损伤的患者病死率为20%[2]。脓毒症心肌损伤给医疗卫生行业和国家经济带来极大负担。拯救脓毒症运动(Surviving Sepsis Campaign,SSC)的国际脓毒症与感染性休克治疗指南(2016)否定了很多以前推荐的诊疗方案,尽管进行了近100次的临床试验,但尚无FDA批准的治疗药物。意味着目前脓毒症心肌损伤诊疗仍然面临诸多难题,如病理生理机制复杂、广泛耐药菌的产生和治疗、医源性损害、医疗费高昂等。研究脓毒症心肌损伤发病机制发生、演变、寻找有效的治疗药物具有重要意义。银杏叶为银杏科植物银杏(Ginkgo Biloba,GB)的干燥叶,是一种广泛应用中药材。银杏叶提取物((Ginkgo Biloba Extract,GBE)主要含有黄酮类化合物(主要是槲皮素,山奈酚,异鼠李素,木犀草素,芦丁,芹菜素和杨梅素)、萜类化合物(包括银杏内酯和白果内酯),长期以来一直被应用于心血管疾病的预防和治疗,对于心肌细胞的保护作用涉及抗炎、抗氧化应激等多个方面。GBE可增加心肌细胞中Hsp72蛋白的表达而降低热应激状态下心肌细胞的氧化损伤;抑制心肌炎症反应及血小板激活改善缺血再灌注导致心肌损伤大鼠的心脏功能,缩小梗死面积,并通过拮抗GRP78和CHOP的表达,减轻内质网应激抑制AGEs诱导的心肌细胞损伤。此外,有细胞实验发现,复方银杏叶颗粒可以改善损伤心肌细胞形态学改变,减轻LDH、CK外漏,降低细胞中MDA、NO水平,增加SOD活性,减少ROS生成而参与受损心肌的保护。如何在脓毒症发生之时或之前保护心肌一直是危重医学领域研究的热点之一,通过对文献的检索发现,目前银杏叶提取物在脓毒症所致心肌损伤中的应用研究较少。心肌梗死时,心肌细胞长期遭受缺血和缺氧,可导致不可逆转的细胞死亡(或凋亡)和心功能障碍,减少心肌细胞凋亡可改善MI后心功能和心脏重塑过程,减轻氧化应激和直接干预抑制凋亡通路可以为治疗提供潜在的分子靶点。microRNA(miRs/miRNAs)是一类非编码RNA分子,可调节基因表达,越来越多的证据表明miRNAs在心脏疾病中发挥重要作用。miR-370一直被认为是肿瘤抑制因子,可以下调内皮素抑制细胞增殖并诱导子宫内膜样卵巢癌细胞凋亡;在胃癌组织和细胞中,通过靶向调节孕激素和脂肪Q受体家族成员4使miR-370明显的下调,研究显示,miR-370的上调可能抑制血管炎症和氧化应激,心肌中miR-370的表达在急性心肌梗死后降低。银杏叶提取物长期以来一直被用于治疗心血管疾病,我们通过体内动物实验发现银杏叶提取物可以抑制脓毒症导致的心肌损伤,通过体外细胞实验发现银杏叶提取物的有效成分银杏双黄酮可以通过miR-370/FOX01抑制氧化应激诱导的细胞凋亡,这一发现为临床应用提供了理论基础在本文中,我们建立了脓毒症大鼠心肌损伤模型,设计了药物预防组,研究银杏叶提取物提前干预大鼠对脓毒症大鼠心肌损伤的保护及生存期的改变,证明了药物的预防价值,体现了中医“未病先防”的理论价值。检测了肌钙蛋白Ⅰ、CK-MB等心肌损伤标记物,检测了IL-6、TNF-α等炎性因子,测定了心肌组织MDA含量和SOD活性,分析了BCL-2,BAX,Caspase-3,Caspase-6蛋白表达变化,观察了大鼠心肌组织细胞的炎症反应和细胞凋亡,提示银杏叶提取物可以通过减轻心肌细胞的氧化应激和减少心肌细胞凋亡对脓毒症大鼠心肌损伤发挥保护作用,改善生存时间。通过细胞实验证明,调控miR-370/FOXO1是银杏双黄酮抑制氧化应激导致的心肌细胞凋亡的机制,这为银杏叶提取物预防保护脓毒症心肌损伤提供了理论依据。第一部分银杏叶提取物对脓毒症大鼠心肌损伤的保护作用[目的]银杏叶提取物是否能减轻脓毒症心肌损伤并对给药时机进行初步研究。[方法]1实验动物分组:清洁级雄性Wistar大鼠96只,按随机数字表将大鼠随机分为4组:假手术组(S组),脓毒症组(C组),预防组(CLP造模前6小时注射银杏达莫注射液,P组),治疗组(CLP后0.5小时注射银杏达莫注射液,T组),每组24只大鼠;每组随机抽取12只,观察生存时间,至72h止。2脓毒症大鼠模型的建立和干预:(1)采用盲肠结扎穿孔法(CLP)建立脓毒症大鼠心肌损伤模型,假手术组打开腹腔,翻动盲肠,不作穿刺处理,放回腹腔,逐层缝合腹壁切口。(2)实验大鼠给药1)假手术组:手术前6h及手术后0.5h各经腹腔注射生理盐水4ml/kg;2)脓毒症组:手术前6h及手术后0.5h各经腹腔注射生理盐水4ml/kg;3)预防组:手术前6h经腹注射银杏达莫注射液4ml/kg,CLP后0.5h经腹腔注射生理盐水4ml/kg;4)治疗组:手术前6h经腹腔注射生理盐水4ml/kg,手术后0.5h经腹注射银杏达莫注射液4ml/kg;3 标本采集及相关指标检测(1)实验大鼠血标本抽取将大鼠分别于造模后6h、12h两个时间点随机选择半数处死,自腹主动脉抽取血标本。用离心机离心后取上清液置于EP管中,置于-80℃低温冰箱保存,待检测;(2)ELISA 法检测肌钙蛋白 Ⅰ、CK-MB、IL-6、TNF-α;(3)心脏病理组织学切片HE染色及光镜检查。4统计学处理利用R3.6.0与Rstudio进行统计分析,实验结果均以均数±标准差(x±s)的形式表示。多组间的比较,若资料满足正态分布和方差齐,采用方差分析进行组间比较,如果组间差异有统计学意义,进一步采用Bonferroni法进行两两比较。如果不服从正态分布,组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验,绘制Kaplan-Meier曲线进行生存分析,进行Log-Rank检验,若P<0.05,则视为有统计学差异。[结果]1.脓毒症大鼠心肌损伤模型造模成功,与假手术组相比,脓毒症组、预防组、治疗组CK-MB及cTnI水平均显著高于假手术组(p<0.05),表明CLP造模后的大鼠发生了心肌损伤;2.CLP造模后,大鼠的存活率均呈下降趋势,预防组存活率最高,治疗组次之,CLP组存活率最低,Log-Rank检验,p<0.05,银杏叶提取物对三组的远期生存率影响差异有统计学意义;预防组较治疗组而言,对脓毒症大鼠的远期预后更有意义;3.与脓毒症组相比,经银杏叶提取物干预的预防组和治疗组CK-MB、cTnI、IL-6及TNF-α水平均有显著的下降(p<0.05),造模前给药的预防组较造模后给药的治疗组水平下降更显著(p<0.05);4.假手术组大鼠心肌组织横纹清晰,细胞排列整齐,无明显的炎症细胞浸润和胞核肿胀,细胞间质无明显充血、水肿、炎症细胞浸润;脓毒症组心肌水肿变性,胞浆淡然,有玻璃样变心肌纤维排列紊乱,出现水肿和核膜破裂、炎症细胞浸润明显,间质水肿,充血,炎细胞浸润;治疗组和预防组心肌细胞水肿减轻,体积变小,间质炎症反应明显改善;与治疗组相比,预防组镜下心肌细胞水肿更轻微,间质炎症反应无明显差异。[结论]银杏叶提取物对脓毒症大鼠的心肌损伤具有保护作用,在发生脓毒症前应用银杏叶提取物,可以明显改善脓毒症大鼠的远期生存预后。第二部分银杏叶提取物对脓毒症大鼠心肌损伤的保护机制研究[目的]研究银杏叶提取物对脓毒症大鼠心肌损伤发挥保护的可能机制。[方法]1实验动物分组:清洁级雄性Wistar大鼠96只,按随机数字表将大鼠随机分为4组:假手术组(S组),脓毒症组(C组),预防组(CLP造模前6小时注射银杏达莫注射液,P组),治疗组(CLP后0.5小时注射银杏达莫注射液,T组),每组24只大鼠。2脓毒症大鼠模型的建立和干预同第一部分。3标本采集及相关指标检测(1)比色法测定心肌组织氧化应激水平取每只大鼠0.2g左心室心肌组织,用预冷的PBS制备组织匀浆,按照试剂盒说明测定各组心肌组织MDA水平和SOD活性。(2)蛋白免疫印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白BAX、BCL-2、Caspase-3、Caspase-6 的表达。(3)TUNEL方法观察银杏叶提取物对脓毒症大鼠的心肌细胞凋亡情况。(4)心肌组织匀浆后,利用qPCR检测miR-370表达量和Western Blot检测FOXO1表达量变化。4统计学处理采用R 3.6.0和Rstudio进行统计学分析,两组计量资料采用t检验,结果均以均数±标准差(x±S)表示。采用方差分析进行各组间均数的比较,P<0.05被认为差异显著。以ImageJ 2.0软件对各组蛋白表达水平进行半定量分析。[结果]1.相对于假手术组,大鼠心肌组织中MDA浓度的显着增加,用GBE治疗后,这些变化明显减少。C组的SOD活性(2-2)显着低于对照组,与C组相比,P组、T组的SOD浓度显着增加;2.与对照组相比,预防组和治疗组中凋亡蛋白BAX与抗凋亡蛋白BCL-2的比例显著增加,裂解的Caspase-3、Caspase-6的活性也显着增加。GBE使脓毒症大鼠中BAX与BCL-2的比率正常化,并降低了裂解的Caspase-3、Caspase-6水平;3.TUNEL染色后观察,S组有非常少量的凋亡细胞,相比之下,C组的凋亡细胞显着增加,GBE处理明显减少了大鼠心肌细胞凋亡的数量;4.CLP组的miR-370表达量明显下调,经过GBE干预后的P组和T组的表达量较C组上调;P组和T组的FOXO1表达量较C组下调。[结论]GBE有通过减轻大鼠心肌细胞炎症反应、氧化应激来抑制细胞凋亡的作用,调控miR-370/FOXO1是GBE抑制氧化应激导致的心肌细胞凋亡的可能机制。第三部分银杏双黄酮调控miR-370/FOXO1抑制心肌细胞氧化应激和凋亡的研究[目的]研究银杏双黄酮调控miR-370/FOXO1在氧化应激和凋亡方面对H2O2诱导的H9C2心肌细胞损伤的影响。[方法]1体外培养H9C2细胞,按照说明书培养、传代,取对数生长期的细胞进行实验研究。2细胞分组处理Normal组 细胞在含FBS的DMEM培养基中正常培养,不作任何处理H2O2组 细胞在含FBS的DMEM培养基中用终浓度100μmol/l H2O2溶液处理24hH202+Ginkgetin组 细胞在含FBS的DMEM培养基中同时用终浓度100μmol/l H2O2溶液和终浓度15μmol/l的银杏双黄酮溶液处理24hH202+Ginkg(?)in+miR-3 细胞在含FBS的DMEM培养基中同时用终浓度100μmol/l H2O2溶液70 inhibitor组 和终浓度15μmol/l的银杏双黄酮溶液处理24h后,敲低miR-3703细胞转染后检测转染水平。4 Western Blot实验,对细胞总蛋白进行提取、测定蛋白质浓度,然后行丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳,再经过转膜、封闭、一抗孵育、二抗结合、显影后,计算目的蛋白的表达强度。5 RT-qPCR:收集对照组和实验组细胞,提取总RNA并检测纯度和完整性,然后去处基因组DNA,经过RNA逆转录后进行RT-qPCR反应。6统计学方法:用R 3.6.0和Rstudio对数据进行统计分析。无特殊说明,所有实验均为重复3次,数据均以均值±标准差(x±S)的形式进行表示。两样本均数间比较采用t检验,多组样本均数间比较采用单因素方差分析。P<0.05被认为差异显著。运用R 3.6.0的ggplot2包进行数据可视化。[结果]1.用H2O2处理H9C2细胞后,Caspase-3(p<0.01)与Caspase-6(p<0.01)表达量上调,而BAX与BCL-2的比值亦增加(p<0.01)。同时,miR-370表达量下调,而FOXO1表达量上调。2.H202处理的H9C2细胞用银杏双黄酮处理后,与H2O2组相比,Caspase-3(p<0.01)与Caspase-6(p<0.01)表达量下调,而BAX与BCL-2的比值亦减少(p<0.01)。qPCR检测miR-370表达量上调,Western Blot检测FOXO1表达量下调,[结论]银杏双黄酮抑制凋亡是通过上调miR-370实现的,调控miR-370/FOXO1是其抑制氧化应激导致的心肌细胞凋亡的机制。