研究背景：硫化氢是继NO、CO之后的第三大气体分子,其在血管活性调节、炎症反应、细胞增殖、凋亡及细胞周期调节、氧化应激和神经递质等方面均有重要功能。已经证实,哺乳动物体内以L-半胱氨酸为底物,通过激活5’-磷酸吡哆醛依赖性酶：胱硫醚-γ裂解酶(cystathionine γ-lyase, CSE)和胱硫醚-β合成酶(cystathionine β-synthase, CBS)生成H2S。H2S对这些酶也有负反馈调节作用,其他酶也能在体内合成少量H2S,但至今没有更多的深入研究。CSE和CBS在哺乳动物组织和细胞中分布广泛。大多数CBS存在于中枢神经系统中,而外周组织中CSE活性较高,尤其是肝、肾及血管。脂肪组织中是CSE。H2S通过扩张血管、抑制血管平滑肌细胞增殖和调节血管平滑肌张力等机制表现出的广泛心血管效应已得到充分证实,而H2S作为一种新兴炎症介质在多种炎症反应和炎性疾病的发展、转归中所扮演的“重要角色”也正逐渐受到众多学者的广泛关注。Oh等在脂多糖诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎症模型中观察到H2S可抑制巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶的表达,提示抗炎症反应可能是H2S的心血管效应之一。Christl证实H2S可以引起人离体结肠细胞过度增殖而参与溃疡性结肠炎的发病。有报道在双侧侧脑室注射脂多糖诱导的神经炎症模型大鼠中,外源性给予硫氢化钠可减轻脂多糖诱导的大鼠学习记忆功能减退及海马CA1区神经元的超微结构损伤,其机制与抑制核转录因子信号通路从而抑制促炎介质的产生有关。随着人民生活水平的提高,胰岛素抵抗(Insulin resistance, IR)已成为一个引起全球关注的问题,IR是向心性肥胖、糖耐量异常、脂质代谢紊乱、高血压、2型糖尿病(type2diabetes mellitus, T2DM)、高尿酸血症、代谢综合症(Metabolic syndrome MS)、甚至是育龄期妇女的多囊卵巢综合症等多种疾病共同的病理生理基础。IR是指血液中胰岛素的生物效应降低,即机体各组织细胞对胰岛素生物调节作用的反应性下降的一种状态,这种状态可导致胰岛素促进葡萄糖摄取的作用受损,从而导致胰岛素代偿性分泌增多,其重要标志为高胰岛素血症,具体表现为外周组织对葡萄糖的利用障碍以及对胰岛素敏感性的下降。美国糖尿病协会定义胰岛素抵抗为对内源性和外源性胰岛素的代谢反应受损,即正常剂量的胰岛素产生低于正常生物效应的一种状态。器官、组织、细胞在完成糖代谢反应时所需的胰岛素用量比正常用量多的一种状态,导致胰腺β细胞分泌更多胰岛素,代偿性产生高胰岛素血症,最终导致糖脂代谢的异常。IR是T2DM的主要危险因素之一。近年研究发现,T2DM是一种慢性低度炎症性疾病,炎症因子可通过增加IR促进T2DM的发生和发展。在炎症、T2DM、IR的病理生理过程中,脂肪组织的分泌功能紊乱扮演了重要角色。目前认为,2型糖尿病是一种慢性低度炎症性疾病,炎症不仅在胰岛素抵抗的过程中起重要作用,而且在糖尿病患者动脉粥样硬化的发生、发展过程中做出重要贡献。然而,糖尿病患者炎症因子增多的机制目前尚不明确。脂肪组织曾一度被认为是能量存储器官,目前已被公认为一个重要的内分泌器官。脂肪细胞能够分泌多种因子,我们统称为脂肪因子,瘦素,抵抗素和脂联素等,是重要的脂肪代谢调节剂,并且在糖脂质代谢的调节中起着重要的作用；肿瘤坏死因子、白细胞介素-6、单核细胞趋化蛋白-1,是炎性细胞因子,参与炎症过程,可导致代谢性疾病、胰岛素抵抗和冠心病；2型糖尿病患者的脂肪细胞因子异常分泌在血管并发症的发病过程中起重要作用。生理情况下,胰岛素信号转导过程需要胰岛素受体底物(IRS)的酪氨酸磷酸化。炎性反应因子激活的一系列激酶如c-jun氨基末端激酶(JNK)、核因子-κB (NF-κB)及其抑制蛋白激酶(IKK)等,可导致IRS的丝氨酸/苏氨酸磷酸化,阻碍正常的酪氨酸磷酸化,导致IRS与胰岛素受体结合,同时激活下游底物磷脂酰肌醇3激酶的能力下降,胰岛素信号转导减弱,从而导致IR。目的：炎症与胰岛素抵抗及2型糖尿病的发生、发展有密切相关。Pickup等研究发现2型糖尿病者血浆TNF-a和IL-6水平明显高于正常对照组。胰岛素抵抗与炎症呈独立相关,并由此推测炎症可能为促进胰岛素抵抗的一个主要原因。如前所述脂肪组织是重要的内分泌器官。脂肪细胞可以分泌多种炎症因子(如IL-6、TNF-a等)和脂肪因子(如瘦素、脂联素等),并且这些炎症因子与脂肪因子的分泌异常,可能参与了胰岛素抵抗的发生。硫化氢与炎症反应及炎症性疾病密切相关,然而,硫化氢对脂肪组织分泌的影响目前尚未见报道。本课题拟通过研究脂肪细胞H2S与脂肪因子的关系,探讨其在胰岛素抵抗及糖尿病中的意义,并为今后的临床工作提供实验依据。方法：1.前脂肪细胞的分化在常规培养条件培养3T3-L1前脂肪细胞,生长至100%融合后继续融合2天,此后为分化0天(DO)。D0:换分化培养基1,培养2天。D2：换分化培养基2,培养细胞2-3天。D4:此后换含10%FBS-DMEM培养基继续培养,坚持每2-3天换液1次,诱导分化第10-12天可见80%-90%分化为脂肪细胞,可用于实验。2.细胞处理待细胞分化为成熟脂肪细胞后,应用5.5mmol/L低糖培养基和25mmol/L高糖培养基分别处理部分前脂肪细胞和分化成熟的脂肪细胞,以处理开始标记为Oh,然后分别于处理0h、6h、2h、24h、48h,收集细胞上清液,存于-80℃冰箱储存；以备后续应用Trizol试剂提取细胞RNA,并用RIPA蛋白裂解液提取细胞目的蛋白,分别将提取的样本标记好后存放于-80℃冰箱备用。取适量100mmol/L NaHS原液,用ddH2O稀释成10umol/L.50umol/L的工作液,分别加入到成熟脂肪细胞的培养基中,于处理细胞第24小时,收集细胞上清液,于-80℃储存。3.慢病毒转染成熟脂肪细胞小鼠前体脂肪细胞3T3-L1接种在96孔培养板,置37℃,饱和湿度,5%CO2培养箱中静置培养；待细胞诱导分化第4天时,弃去旧培养基,分别加入小鼠CSE慢病毒悬液及对照-慢病毒悬液,置5%CO2培养箱；培养12h后观察细胞状态,与未转染细胞无明显差异,慢病毒对3T3-L1无明显毒性作用,继续培养；细胞转染并培养24h后镜下观察细胞内荧光蛋白的表达情况,并更换新鲜培养基；培养48h后,按照实验分组分别更换培养基,继续培养24h后分别收集各组细胞上清液,同时提取细胞目的蛋白。4.CSE表达测定分别用实时定量RT-PCR及Western blot方法检测CSE在不同条件下的表达水平。5.脂肪因子测定酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay, Elisa)测定MCP-1、ADP;放射免疫法测定TNF-α。结果：1.高糖下调前脂肪细胞及脂肪细胞中CSE蛋白表达本实验证实在高糖状态下,3T3-L1细胞中CSE在蛋白表达水平明显减少,并且在成熟脂肪细胞中该趋势更为明显,提示H2S水平在脂肪细胞中明显下降。2.高糖可在mRNA水平下调分化成熟的脂肪细胞CSE表达我们应用real time RT-PCR的方法测定CSE的mRNA水平,研究证明,自12小时开始,可观察到高糖处理分化成熟3T3-L1脂肪细胞CSE水平的下降趋势,48小时达下降高峰。3.CSE高表达对分化成熟3T3-L1脂肪细胞分泌脂联素及炎症因子的影响高糖可使成熟脂肪细胞分泌MCP-1增加,使脂联素分泌减少,而对TNF-α无明显影响；将载有CSE基因的慢病毒导入成熟脂肪细胞中,使CSE基因过表达,可部分减少高糖所致MCP-1的增加,并增加脂联素分泌。4.外源性NaHS对分化成熟3T3-L1脂肪细胞分泌脂联素及炎症因子的影响：与CSE基因过表达结果一致,给予NaHS (H2S供体),可部分减少高糖所致MCP-1的增加,并增加脂联素分泌。结论：高糖诱导3T3-L1脂肪细胞MCP-1分泌增加,脂联素分泌减少,其机制之一可能与抑制CSE表达,减少H2S生成有关。