论文部分内容阅读
目的:肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因,发病率呈现逐年上升趋势,其中非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）占所有肺癌病例的85%,5年生存率不足20%。对于早期NSCLC患者,手术仍是首选的治疗方案,但有高达45%的早期NSCLC患者会出现术后复发,因此对患者的动态评估和预后分析有利于临床医生的治疗决策,具有重要的临床意义。循环异倍体细胞（circulating aneuploidy cells,CAC）监测作为一种无创,可重复性的检测手段,可以为个体治疗和预后评估提供大量的信息,在肿瘤诊断、疗效鉴定和预后预测等方面发挥重要作用。本研究旨在通过采用全新的差相富集-免疫荧光染色原位杂交（Subtraction enrichment-immunofluorescence in situ hybridization,SE-iFISH）检测平台,对可切除NSCLC患者的CAC细胞及其各表型和/或核型亚型进行全面深入分析,并探讨其与患者预后的关系。此外,随着全球吸烟率的降低,非吸烟相关肺癌比例增加。非小细胞肺癌中的肺腺癌（Lung adenocarcinoma,LUAD）病理亚型是非吸烟相关肺癌的主要组成部分,具有转移能力强、预后差的特点,引起广泛关注。近年来表观遗传学修饰,特别是非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）在肿瘤发生发展中的作用被广泛报道,能够在多种肿瘤中发挥重要作用。本研究采用生物信息学分析的方法筛选LUAD预后相关ncRNA;继而使用真实世界患者组织标本,验证特异ncRNA在患者预后评估中的效果;并进一步研究特异ncRNA对肺腺癌生物学特征的影响,以及微小RNA（microRNA,miRNA）与上游circRNA、下游靶基因mRNA的相互作用关系和分子调控机制。研究结果有望为肺腺癌复发、转移及预后提供新的生物标志物,为ncRNA的调控机制提供新的理论证据基础。方法:收集术前50名及术后35名可切除NSCLC患者的外周血样本7.5mL/人,借助SE-iFISH检测平台,通过鉴定非血细胞的8号染色体异倍体核型从而检测外周血CAC,并对其进行大小及核型两个维度的分型;结合患者临床病理特征及预后资料,对CAC各亚型与NSCLC患者临床资料及无病生存期（disease free survival,DFS）的关系进行深入分析。此外,下载并分析来自癌症基因组图谱（The cancer genome atlas,TCGA）的miRNARNA-seq及临床资料数据包,筛选LUAD患者的总生存期（Overall survival,OS）相关的miRNA;采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR,qPCR）检测肺腺癌细胞系及73个肺腺癌组织与对应正常组织中miR-421、circ＿0000567和TMEM100的表达水平;采用Wound healing和Transwell两种实验方法检测细胞迁移和侵袭能力;使用多个生物信息学数据库进行miR-421靶标预测,筛选出miRNA上游的竞争性内源性RNA（competitive endogenous RNA,ceRNA）circ 0000567和下游的靶基因TMEM100;通过RNaseR酶切实验以及使用Oligo（dT）或随机引物逆转录的qPCR实验验证circ＿0000567的环状结构和稳定性;采用双荧光素酶报告基因实验鉴定miR-421与circ＿0000567或TMEM100之间的结合关系。结果:我们的研究获得如下三部分主要结果:第一,以CAC直径大小对可切除NSCLC患者外周血CAC分型时,小CAC（直径≤5μm）数量占CAC总数的20%以下,而大CAC（直径>5μm）占CAC总数的80%以上。CAC核型包括三倍体,四倍体和多倍体,进一步根据不同核型将大、小CAC分为不同核型亚型时发现,三倍体亚型占小CAC的大部分,而多倍体亚型占大CAC的大部分。治疗前外周血中小CAC及三倍体小CAC阳性是患者不良预后因素,且二者与TNM分期更晚及患者复发显著相关（P<0.05）。术后CAC不具有上述临床意义。术后CAC及其各亚型数量均有轻微升高,但术后CAC及术前、术后CAC数量变化的趋势与DFS无关。第二,对TCGA数据库下载的LUAD患者RNA-seq及临床资料数据进行生物信息学分析,根据危险比从高到低筛选出与LUAD患者OS相关的miRNA共61个。采用Kaplan-Meier（K-M）法进一步验证发现miR-3940、miR-873、miR-550-2、miR-1293、miR-421 和miR-212这6个miRNA可能与LUAD患者OS密切相关。基于风险比及相对表达量,选择miR-421进行深入研究。miR-421在我科LUAD组织标本73例中高表达,且为患者OS较短的独立危险因素。第三,在73个LUAD组织标本中,miR-421的相对表达量与TMEM100成反比,而与circ＿0000567成正比。肺腺癌细胞中的生物信息学分析、双荧光素酶报告基因实验和细胞功能实验表明,circ＿0000567可以作为ceRNA吸附miR-421,阻止其直接靶向TMEM100 mRNA的3’-非翻译区（3’-Untranslated region,3’-UTR）,并进一步使其降解。细胞功能实验证实miR-421促进了 LUAD细胞的迁移和侵袭,而circ＿0000567可抑制迁移和侵袭。恢复实验则进一步证实miR-421可部分抵消circ＿0000567对肿瘤细胞的抑制作用。在LUAD细胞中,miR-421可以负向调控TMEM100的表达,且circ＿0000567过表达可以上调TMEM100的表达。结论:我们的研究结果提示术前小CAC,特别是其三倍体核型,可作为可切除NSCLC患者的潜在预后生物标志物;miR-421可作为LUAD患者潜在预后生物标志物;且miR-421能够被circ＿0000567所“吸附”,进而使miR-421无法靶向下游靶基因并抑制其功能,使下游靶基因TMEM100得到释放,从而发挥促进肺腺癌的迁移和侵袭的作用。我们的研究可能成为非小细胞肺癌临床预后模型的重要元素。