自拟凉血消疕汤治疗寻常型银屑病临床观察及其作用机制研究

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目的:1.观察凉血消疕汤治疗寻常型银屑病的临床疗效及安全性。2.通过体外传代培养人永生化角质形成细胞株(HaCaT),观察不同浓度凉血消疙汤含药血清对HaCaT细胞增殖、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响并探讨其治疗银屑病的作用机制。为凉血消疕汤在临床的广泛应用提供理论基础。方法:一.观察凉血消疕汤治疗寻常型银屑病的临床疗效1病例来源2005年8月-2008年3月武汉市第一医院皮肤科银屑病专科门诊患者,临床诊断寻常型银屑病,皮损面积小于30%体表面积,就诊前一月未经口服中药治疗未接受免疫抑制剂治疗的患者46例。2患者按随机数字表法分为2组,两组在年龄、性别、病程、严重程度上无显著性差异(P>0.05),具有可比性。治疗组26例服用凉血消疕汤,每日一剂,分两次口服。对照组20例服用郁金银屑片,每日3次,每次4片。局部治疗二组均采用10%煤焦油软膏。每2周为1疗程,连续观察8周后根据银屑病皮损面积和严重度指数PASI评分系统,来评价临床疗效。同时监测患者血尿常规,肝肾功能,记录不良反应。3观察结束后采用SPSS14.0软件系统对结果进行分析。二.观察不同浓度凉血消疕汤含药血清对HaCaT细胞增殖及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响1体外培养HaCaT细胞传至第三代备用。当细胞融合80%以上时,加入0.25%胰酶消化,37℃、5%CO2培养箱中孵育5min,倒置显微镜下观察细胞形态,细胞变圆,细胞间连接中断,加入适量培养基终止消化,轻轻吹打瓶壁使细胞呈单细胞悬液,添加适量培养基吹打混匀,接种至96孔板备用。2大鼠灌胃制备盐水,低、中、高剂量凉血消疙汤血清分别作用于HaCaT细胞。将24只大鼠随机分为4组,空白对照组(生理盐水),凉血消疕汤低、中、高剂量组(0.5g/ml、1g/ml、2g/ml),每组6只,雌雄各半。给药组,每天灌胃给药一次,连续7天;对照组,每天灌服等量生理盐水。具体灌胃剂量按照《中医科研设计与统计学》(湖南科学技术出版社48实验动物给药方法52中药血清药理学方法)计算。末次灌胃1h后取血,分离血清,-20℃冰箱保存备用。3采用MTT法观察凉血消疙汤含药血清对细胞增殖影响。调整细胞数至2×104的密度接种于96孔板,细胞70%-80%融合后弃去原培养液,加入无血清的DMEM培养基培养4小时后去上清,加入各组受试品,在酶标仪上测OD值。4运用ELIsA法检测上清液中VEGF的表达,调整细胞数至1×105接种于24孔板,细胞70%-80%融合后弃去原培养液加入各组受试品,培养24小时后取上清按照人VEGF ELISA试剂盒(深圳晶美)步骤操作。结果:一.临床观察根据PASI评分下降比值,治疗组痊愈率7.69%,显效率57.69%,总显效率65.38%;对照组痊愈率5%,显效率30%,总显效率35%;治疗组总显效率高于对照组,经统计学分析差异有统计学意义(P<0.05)。治疗前,治疗组患者PASI评分9.64±3.86,对照组PASI评分9.58±2.48。治疗后,治疗组患者PSAI评分4.23±3.55,对照组患者PASI评分5.48±3.83,两组患者治疗后总评分比较差异有显著统计学意义(P<0.01),治疗组优于对照组。二.实验研究1.抑制细胞增殖:各实验组分别作用HaCaT细胞24小时后,HaCaT细胞组OD492为0.961±0.028,TGF-α刺激HaCaT细胞组OD492为1.163±0.073,生理盐水大鼠血清组OD492值为1.098±0.067,低、中、高含药血清组OD492值分别为0.908±0.041、0.914±0.096、0.553±0.159,TGF-α刺激空白组OD492值明显高于空白组OD492(P<0.05)随药物浓度梯度的升高,各含药血清组细胞增殖活性逐渐降低,与盐水组比较差异有统计学意义(P<0.05),各加药组组间比较,低剂量组与中剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05),高剂量组与盐水血清组,低、中剂量组比较差异均有显著统计学意义(P<0.01)。2.抑制VEGF分泌:各实验组分别作用HaCaT细胞24小时后,VEGF表达量HaCaT细胞组OD450值为0.47 3±0.142,TGF-α刺激HaCaT细胞组OD450值为1.007±0.261,生理盐水大鼠血清组OD450值为1.500±0.041,低、中、高含药血清组OD450值分别为1.185±0.133、0.964±0.403、0.33±0.067,TGF-α刺激HaCaT细胞组OD450值与HaCaT细胞组OD450值比较差异有显著统计学意义(P<0.01),并且随着药物浓度梯度的升高,各含药血清组VEGF分泌量逐渐降低,与盐水组比较差异有显著统计学意义(P<0.01),各加药组组间比较差异亦有显著统计学意义(P<0.01)。经相关回归分析显示,VEGF表达量与呈高度负相关,r=-0.998,P<0.01。提示以上各凉血消疕汤含药血清对HaCaT细胞VEGF分泌有明显抑制作用,且具有浓度效应关系。结论:1.凉血消疕汤对寻常型银屑病临床治疗作用显著,明显优于对照组。2.凉血消疙汤含药血清能够抑制HaCaT细胞增殖,有效下调HaCaT细胞VEGF的分泌量,抑制VEGF表达,从而抑制血管新生,这可能是其临床治疗银屑病的药理作用机制之一。
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