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研究目的:Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是天然免疫系统中特异的Ⅰ-型跨膜受体及病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)识别受体,参与急性炎症反应、细胞信号转导和细胞凋亡。尽管TLRs及其功能在免疫细胞中已被熟知,但其在中枢神经系统中的功能还不明了。Toll样受体2(TLR2)和9(TLR9)在中枢神经系统中分布广泛并发挥重要作用.吗啡是强效镇痛剂,但其滥用可以产生有害的生理作用。我们前期的研究证明,不管在体内实验还是体外实验,吗啡均能阻止细胞的生长并诱导凋亡。在中枢神经系统,吗啡可诱导神经元凋亡。但是Toll样受体是否介导吗啡诱导中枢神经系统神经元及小胶质细胞凋亡及其作用机制目前尚不清楚。研究方法:本研究分三部分:(1)利用原代培养的野生型和TLR2基因敲除型神经元研究TLR2信号通路在吗啡诱导神经元凋亡中的作用。采用RT-PCR和免疫荧光法分别检测吗啡刺激后野生型神经元中TLR2 mRNA及蛋白的表达。以PI及TUNEL染色检测野生型及TLR2基因敲除型神经元中的凋亡细胞数。WesternBlot和免疫荧光检测活化的caspase-3及磷酸化的GSK3β的蛋白表达。(2)利用HEK293细胞及TLR2高表达HEK293(TLR2/HEK293)细胞研究新型化合物白藜芦醇脂肪酸R6A阻断TLR2诱导凋亡的作用及其作用机制。采用TUNEL染色检测HEK293及TLR2/HEK293细胞中的凋亡细胞数。Western Blot检测TLR2,磷酸化的Akt及磷酸化的GSK3β的蛋白表达。(3)利用原代培养的野生型,TLR9基因敲除型和μ受体基因敲除型小胶质细胞研究TLR9在吗啡诱导小胶质细胞凋亡中的作用机制。RT-PCR检测吗啡刺激后野生型小胶质细胞中TLR9 mRNA时间依赖及剂量依赖关系,检测小胶质细胞活化的标志CD11b mRNA时间依赖及剂量依赖关系。TUNEL染色检测野生型及TLR9基因敲除型小胶质细胞中的凋亡细胞数。免疫荧光检测吗啡刺激后野生型,TLR9基因敲除型及μ受体基因敲除型细胞中活化的caspase-3的表达。RT-PCR检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α),白介素1β(interlukin-1β,IL-1β)及白介素6(interlukin-6,IL-6)的表达。Western Blot检测磷酸化的GSK3β及磷酸化的P38的蛋白表达。结果:(1)在原代培养的神经元中,吗啡诱导野生型神经元TLR2 mRNA呈时间依赖性增加,蛋白含量亦增加,阿片类受体阻断剂纳络酮可以阻断吗啡的作用;PI和TUNEL结果显示TLR2的缺失可以阻止吗啡诱导的神经细胞凋亡;WesternBlot和免疫荧光证明吗啡可引起野生型神经元中caspase-3活化,却不能引起TLR2基因敲除神经元caspase-3的活化,同时TLR2介导吗啡使磷酸化的GSK3β蛋白表达减少。(2)新型化合物白藜芦醇脂肪酸R6A 100μM浓度可以阻断血清撤除12小时和24小时诱导TLR2/HEK293细胞中TLR2蛋白的表达。TUNEL结果显示R6A能够显著的减少TLR2/HEK293细胞中的凋亡细胞数。R6A阻断TLR2的作用可以阻止血清撤除所引起的磷酸化的Akt和磷酸化的GSK3β蛋白表达的减少。(3)在原代培养的小胶质细胞中,吗啡诱导野生型小胶质细胞TLR9 mRNA呈时间、剂量依赖性增加,阿片类受体阻断剂纳络酮可以阻断吗啡的作用,μ受体激动剂DAMGO亦可诱导TLR9表达增加,但是μ受体基因敲除的小胶质细胞中,TLR9的表达没有改变。TUNEL分析显示吗啡可以使野生型小胶质细胞凋亡细胞数显著增加,却不能诱导TLR9基因敲除型小胶质细胞凋亡。免疫荧光检测吗啡刺激后野生型,TLR9基因敲除型及μ受体基因敲除细胞中活化的caspase-3的表达显示,吗啡可以诱导野生型小胶质细胞中caspase-3活化,表达增加,却不能诱导TLR9基因敲除及μ受体基因敲除细胞中caspase-3表达增加。小胶质细胞激活标志物CD11b结果揭示,吗啡可以使野生型小胶质细胞中CD11b表达呈时间、剂量依赖性增加,与TLR9的变化一致,而不能使μ受体基因敲除的小胶质细胞CD11b表达发生变化,说明吗啡通过μ受体激活小胶质细胞,从而引起TLR9表达增加,介导了细胞凋亡。小胶质细胞是中枢神经系统中的免疫细胞,可以诱导细胞因子的表达,我们采用RT-PCR技术检测炎症因子显示,TLR9可以介导吗啡诱导的小胶质细胞炎症因子TNF-α、IL-1β及IL-6表达增加。Western Blot结果显示,TLR9介导吗啡使磷酸化的GSK3β蛋白表达减少,而磷酸化的P38的蛋白表达增加。结论:本实验证明:(1)TLR2经GSK3β,caspase-3途径介导了吗啡诱导的神经元凋亡。(2)新型化合物R6A能有效的阻止TLR2的表达,从而减少TLR2过表达所引起的细胞凋亡,并且我们的研究揭示了R6A阻断TLR2诱导细胞凋亡经过Akt/GSK3β途径。(3)吗啡经过μ受体诱导小胶质细胞凋亡,TLR9通过GSK3β,P38,caspase-3途径介导了吗啡诱导的小胶质细胞凋亡。同时TLR9可调控炎症因子的表达,从而诱导细胞凋亡。意义:本研究首次揭示了TLR2在吗啡诱导神经元凋亡中的重要作用,为进一步研究吗啡的神经毒性提供了理论基础;新型化合物R6A可阻断TLR2的表达,为其发展成治疗TLR2介导疾病的自主产权的创新药物奠定了基础;我们首次研究了TLR9介导吗啡诱导胶质细胞凋亡的机制,为深入阐明吗啡在中枢神经系统中的损伤作用提供了实验依据,为进一步研究神经元与胶质细胞相互作用提供了切入点。