研究背景及目的宫腔粘连（intrauterine adhesion,IUA）又称Asherman综合征,由Fritsch于1894首次报道,1948年由Asherman首次详细报道并定义为:因子宫内膜损伤导致宫腔部分或全部闭塞,常伴发月经异常、不孕、反复流产与周期性腹痛等临床症状^[1]。近年来,随着宫腔内各种手术操作的增加及诊断手段的不断改进,IUA的发病率不断上升^[2]。目前认为子宫内膜基底层的机械性损伤是导致宫腔粘连的主要原因^[3],尤其是妊娠期间的刮宫手术被认为是其主要病因^[4]。其次是子宫内膜感染等因素导致的宫腔粘连。尽管目前治疗IUA的方法较多,但是治疗后的复发率较高,尤其是重度IUA,往往继发不孕和反复流产。因此,需要在深入研究宫腔粘连的确切发病机制的基础上来研究更加有效的治疗方法。宫腔粘连的本质是子宫内膜基底层损伤后导致的子宫内膜纤维化^[5]。有研究发现宫腔粘连患者的子宫内膜中有细胞外基质蓄积,子宫内膜逐渐被纤维结缔组织取代,最终形成宫腔粘连^[6]。赖氨酰氧化酶（1ysyl oxidase,LOX）属于铜依赖性胺氧化酶类,它可以催化弹性蛋白和胶原蛋白分子的赖氨酸和羟赖氨酸残基发生氧化脱氨基作用形成分子内和分子间共价键,共有5个结构相似的成员组成:赖氨酰氧化酶（LOX）,赖氨酰氧化酶样-1（LOXL1）,赖氨酰氧化酶样-2（LOXL2）,赖氨酰氧化酶样-3（LOXL3）,赖氨酰氧化酶样-4（LOXL4）,赖氨酰氧化酶家族是胶原纤维及弹性纤维交联形成的主要催化酶^[7,8],因此赖氨酰氧化酶家族对于纤维结缔组织的形成和细胞外基质的稳定至关重要^[9,10]。有多个研究显示,赖氨酰氧化酶家族成员在肝脏、肾脏、肺脏等多个器官的纤维化病理过程中发挥重要作用^[11-15]。我们推测赖氨酰氧化酶家族在子宫内膜纤维化中很可能也发挥重要作用。但赖氨酰氧化酶家族成员在人及大鼠子宫内膜纤维化中的作用机制尚未见详细报道。TGF-β1被认为是纤维化的启动因子^[16]。TGF-β1与其特异性受体结合后激活TGF-β/Smad2通路,并通过不同途径诱导collagenⅠ、collagenⅢ等细胞外基质的合成和分泌,同时可以降低蛋白水解酶的合成和分泌,促进蛋白水解酶抑制剂的合成,最终导致细胞胶原纤维蓄积,纤维化形成^[17-18]。Hu等^[19]研究发现TGF-β1在IUA患者子宫内膜中表达增加,IUA患者子宫内膜纤维化程度增加。Umme等^[20]的研究同样发现TGF-β1/Smad信号通路的关键蛋白TGF-β1和Smad3在纤维化子宫内膜中表达增加,而且使用特异性阻断剂阻断Smad3后TGF-β1,Smad3表达下降,子宫内膜纤维化程度下降,表明TGF-β1/Smad3信号通路在子宫内膜纤维化过程中发挥重要作用。本研究通过检测人及大鼠正常子宫内膜、人纤维化子宫内膜和子宫内膜纤维化大鼠模型的子宫内膜中的赖氨酰氧化酶家族成员的表达水平变化,探索赖氨酰氧化酶家族的表达与与子宫内膜纤维化的相关性;通过给子宫内膜纤维化模型大鼠腹腔注射赖氨酰氧化酶家族的特异性抑制剂β-氨基丙腈（β-Aminoproprionitrile,β-APN或BAPN）后检测TGF-β1/Smad信号通路关键蛋白的表达来研究赖氨酰氧化酶家族和TGF-β1/Smad信号通路在子宫内膜纤维化中的关系,初步阐述赖氨酰氧化酶家族成员在子宫内膜纤维化中的作用机制,为子宫内膜纤维化的治疗寻找有效靶点。研究方法一、检测赖氨酰氧化酶家族在正常人子宫内膜及纤维化子宫内膜中的表达特点1、采用免疫组织化学法检测正常人和宫腔粘连病人纤维化子宫内膜赖氨酰氧化酶家族的表达。2、蛋白免疫印迹实验检测正常人和宫腔粘连病人纤维化子宫内膜赖氨酰氧化酶家族蛋白表达量的变化。二、检测赖氨酰氧化酶家族在正常Wistar大鼠子宫内膜和机械刮宫后不同时间点大鼠子宫内膜中的表达特点1、24只Wistar大鼠通过机械搔刮子宫腔的方法建立纤维化子宫内膜大鼠模型,术后大鼠子宫自然愈合,并分别在术后24小时、48小时、72小时,7天各随机选取6只大鼠麻醉后取出双侧子宫标本。2、采用免疫组织化学法检测正常大鼠子宫内膜和机械刮宫后大鼠子宫内膜中赖氨酰氧化酶家族的表达。4、采用苏木素-伊红和masson染色法分别评估大鼠子宫内膜的组织形态学变化和胶原含量的变化5、采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法分别检测正常大鼠子宫内膜和机械刮宫后术后24小时、48h小时、72小时和7天时大鼠子宫内膜中赖氨酰氧化酶家族mRNA和蛋白量的表达差异。三、β-氨基丙腈抑制赖氨酰氧化酶活性后对Wistar大鼠子宫内膜纤维化的作用以及对TGF-β1/Smad信号通路的影响1、实验组大鼠通过机械搔刮子宫腔建立子宫内膜纤维化大鼠模型,机械刮宫后,大鼠每天以200mg/kg/d的剂量腹腔注射赖氨酰氧化酶的特异性抑制剂β-氨基丙腈,并分别在术后24小时、48小时、72小时,7天各选取6只大鼠麻醉后取出双侧子宫标本。2、使用赖氨酰氧化酶活性检测试剂盒检测正常大鼠子宫内膜、机械刮宫后大鼠子宫内膜（对照组）、机械刮宫后给予200mg/kg/d剂量β-氨基丙腈治疗的大鼠子宫内膜（实验组）中赖氨酰氧化酶的活性。3、采用苏木素-伊红和masson染色法分别评估各组大鼠子宫内膜的组织形态学变化和胶原含量的变化。4、采用羟脯氨酸试剂盒检测各组大鼠子宫内膜中不可溶胶原的羟脯氨酸含量。通过羟脯氨酸的测定,可以反映胶原蛋白的含量。5、采用免疫组化法检测各组大鼠子宫内膜中TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3的表达。6、采用实时荧光定量PCR法分别检测各组大鼠子宫内膜在不同时间点TGF-β1、Smad2、Smad3在mRNA水平表达量的变化。7、采用蛋白免疫印迹法检测各组大鼠子宫内膜在不同时间点CollagenI、TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达量的变化。四、统计学处理实验数据以平均值±标准差（mean±SD）的方式表示,使用SPSS16.0软件进行统计分析。两组间的数据比较,采取单因素方差分析,组内两两数据比较采用T检验方法。P<0.05具有统计学差异,P<0.01具有统计学显著差异。研究结果一、赖氨酰氧化酶家族在正常人及人纤维化子宫内膜中均有表达,在正常Wistar大鼠子宫内膜和机械刮宫后不同时间点大鼠子宫内膜中均有表达,且其家族成员中的LOX、LOXL1在人和大鼠纤维化子宫内膜中的mRNA及蛋白表达量均显著升高,提示LOX、LOXL1与大鼠子宫内膜纤维化相关。1、免疫组织化学结果显示,在正常人子宫内膜组织、人纤维化子宫内膜组织、正常Wistar大鼠子宫内膜组织和大鼠纤维化子宫内膜中LOX、LOXL1、LOXL2、LOXL3、LOXL4均有表达。2、实时荧光定量PCR检测结果显示,在机械损伤后的48小时、72小时、7天的大鼠子宫内膜中LOX、LOXL1的mRNA表达量均显著升高（P<0.01）。LOXL2mRNA的表达量在机械损伤后的72小时、7天的大鼠子宫内膜中均升高（P<0.05）。提示LOX、LOXL1与大鼠子宫内膜纤维化相关。3、蛋白免疫印迹实验结果提示,人粘连子宫内膜组织中LOX、LOXL1表达较正常人子宫内膜显著升高（P<0.01）。在纤维化大鼠子宫内膜中LOX、LOXL1表达量较正常组大鼠子宫内膜显著升高（P<0.01）,LOXL2有一定程度升高但不显著（P<0.05）。提示LOX、LOXL1与人和大鼠子宫内膜纤维化相关。二、抑制赖氨酰氧化酶活性后子宫内膜纤维化程度减轻,提示赖氨酰氧化酶与大鼠子宫内膜纤维化关系密切。1、Masson染色结果显示:对照组大鼠在机械刮宫72小时、7天子宫内膜蓝染程度较正常组大鼠子宫内膜蓝染程度明显加重（P<0.01）。实验组大鼠子宫内膜在使用β-氨基丙腈治疗后72小时和7天的子宫内膜的蓝染程度较对照组大鼠子宫内膜的蓝染程度明显减轻（P<0.01）。表明机械刮宫可导致子宫内膜纤维化。使用β-氨基丙腈治疗后的纤维化大鼠子宫内膜胶原含量减少,纤维化程度降低（P<0.01）。提示子宫内膜纤维化大鼠模型建模成功,赖氨酰氧化酶与大鼠子宫内膜纤维化相关。2、羟脯氨酸试剂盒检测结果提示:对照组大鼠在机械刮宫后72小时和7天时其子宫内不可溶性胶原的羟脯氨酸含量显著增加（P<0.01）。实验组大鼠在β-氨基丙腈治疗72小时和7天时其子宫内不可溶性胶原的羟脯氨酸含量显著降低（P<0.01）。提示子宫内膜纤维化大鼠模型建模成功,β-APN可抑制大鼠子宫内膜纤维化,赖氨酰氧化酶与大鼠子宫内膜纤维化相关。3、蛋白免疫印迹实验检测CollagenI蛋白结果显示:在对照组大鼠机械刮宫后48h、72h和7d大鼠子宫的CollagenI蛋白表达量均较正常组大鼠显著上升（P<0.01）。提示大鼠子宫内膜机械损伤可导致内膜纤维化,子宫内膜纤维化大鼠建模成功。实验组大鼠在机械刮宫后给予β-APN治疗48小时、72小时和7天时大鼠子宫collagenⅠ蛋白的表达量较相应时间点对照组大鼠显著减少（P<0.01）,提示子宫内膜纤维化大鼠模型建模成功,β-APN可抑制大鼠子宫内膜纤维化,赖氨酰氧化酶与大鼠子宫内膜纤维化相关。三、赖氨酰氧化酶可能是通过TGF-β1/Smad信号通路在子宫内膜纤维化中发挥作用1、赖氨酰氧化酶活性检测结果显示:机械刮宫后大鼠子宫赖氨酰氧化酶活性逐渐升高,机械刮宫后72小时后其活性显著升高（P<0.01）。β-氨基丙腈治疗48小时后各时间点实验组大鼠子宫赖氨酰氧化酶活性较相同时间点对照组大鼠子宫显著降低（P<0.01）。提示β-氨基丙腈可有效抑制大鼠子宫赖氨酰氧化酶活性2、HE染色结果显示:对照组大鼠子宫内膜机械损伤后7天,子宫内膜腺体数量减少,腺体扩张,子宫内膜组织形态差。与对照组相同时间点相比,实验组大鼠用β-氨基丙腈治疗子宫内膜组织形态,腺体形态,宫腔形态都恢复的更好。3、免疫组织化学结果显示:在正常大鼠子宫内膜组织和机械损伤后大鼠子宫内膜中TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3均有表达且集中表达在损伤子宫内膜组织及其腺体内。4、实时荧光定量PCR实验结果显示:对照组大鼠子宫TGF-β1 mRNA在不同时间点均较正常组大鼠显著升高（P<0.01）,Smad2和Smad3的mRNA表达量在刮宫后48小时后各时间点表达量均显著升高。β-氨基丙腈治疗后各时间点实验组大鼠子宫的TGF-β1 mRNA的表达量均对照组显著下降（P<0.01）,β-氨基丙腈治疗48小时后的各时间点实验组大鼠子宫的Smad2和Smad3的mRNA表达量均较对照组显著下降（P<0.01）。提示在大鼠子宫内膜纤维化形成过程中TGF-β1/Smad信号通路与赖氨酰氧化酶相关。5、蛋白免疫印迹实验结果显示:对照组大鼠子宫TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2和p-Smad3在机械刮宫后72小时和7天的蛋白表达量均显著高于正常大鼠子宫（P<0.01）。实验组大鼠子宫内膜中TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2和p-Smad3的蛋白表达量在刮宫72小时及7天时显著低于相应时间点对照组大鼠子宫（P<0.01）。提示在大鼠子宫内膜纤维化形成过程中TGF-β1/Smad信号通路与赖氨酰氧化酶相关。结论1、赖氨酰氧化酶家族在正常人子宫内膜和宫腔粘连患者子宫内膜中均有表达。2、赖氨酰氧化酶家族在正常大鼠子宫内膜和纤维化大鼠子宫内膜中均有表达。3、LOX、LOXL1与人和大鼠的子宫内膜纤维化形成关系密切。4、LOX、LOXL1在大鼠子宫内膜纤维化形成过程中与TGF-β1/Smad信号通路关系密切。