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目的:精子发生进程是涉及到多个环节和多种调节方式的复杂进程,其中减数分裂是生殖细胞特有的方式,同时也是发生多种调控的重要环节,研究减数分裂对了解精子发生异常有重要意义。本研究运用条件型敲除小鼠为模型研究miRNA进程关键酶Dicer1和蛋白磷酸酶PP2A的C亚单位α亚基在减数分裂前期和早期中的作用。方法:利用条件型敲除小鼠Dicer1条件敲除小鼠及PP2ACα条件敲除小鼠与特异性在精原细胞及前细线期精母细胞中表达的Stra8-cre小鼠交配,通过剪脚趾标记并抽提基因组DNA,利用特定引物PCR鉴定基因型,经过两代交配获得在减数分裂前及前细线期精母细胞中纯合敲除Dicer1的小鼠或敲除PP2ACα的小鼠。用同窝杂合敲除小鼠及野生型小鼠做对照,观察称重研究纯合敲除小鼠睾丸发育状况;取不同时间点的小鼠睾丸,做组化切片HE染色,观察不同时间点曲细精管发育状况和精子发生进程;用不同时间点的小鼠睾丸组化切片做Tunel实验,检测在精子发生过程中各级细胞凋亡情况;抽提睾丸总RNA反转录为cDNA做real-time PCR验证基因敲除效果,检测敲除后精子发生标志基因表达水平的变化;或抽提睾丸蛋白,通过western-blot测定蛋白水平的敲除效果;取性成熟雄鼠睾丸,消化成单细胞后送流式分析,比较纯合敲除小鼠与对照小鼠睾丸中单倍体细胞数比例;将性成熟纯合敲除雄鼠及对照雄鼠分别与野生型雌鼠交配,统计产生的后代数量,比较敲除后雄鼠的生育力。结果:获得了在减数分裂前和前细线期纯合敲除Dicer1或PP2ACα的雄鼠,在出生后14天减数分裂期时,纯合敲除小鼠与对照小鼠睾丸差别不大;随精子发生进程进行,在第一波生精波结束时,纯合敲除小鼠与对照小鼠睾丸已出现较大差距,Dicer1敲除小鼠睾丸差距更大,为对照小鼠的70%。在性成熟后Dicer1敲除小鼠睾丸仅为对照小鼠一半;HE染色结果显示敲除小鼠部分管腔内精子发生缺陷,缺乏通过减数分裂的精细胞和成熟精子,有部分严重管腔出现空泡化现象,同时也存在部分基本正常的管腔,在附睾中也可见到少量成熟精子,但在表型正常的管腔中,也可以见到因为核固缩而深染的精原或精母细胞,说明部分精原精母细胞开始凋亡,同样在敲除小鼠附睾内也存在明显的颗粒状脱落细胞;杂合敲除小鼠睾丸重量及管腔内精子发生与野生型小鼠无明显区别,附睾内存在大量精子,杂合敲除并没有产生明显影响;real-time PCR结果显示纯合敲除小鼠睾丸内Dicer1表达量降低了80%,同时干细胞多能性基因Oct4表达也降低了约80%,但精子发生晚期精细胞特异的Prm1、Prm2、Tnp1、Tnp2则差异不大;Tunel结果显示P14天开始纯合敲除小鼠睾丸曲细精管内凋亡细胞已经增多,成年后敲除小鼠曲细精管腔内凋亡细胞也明显多于对照小鼠,同时在敲除小鼠附睾管腔内也可以见到明显的脱落细胞,对照小鼠附睾内则完全没有脱落细胞。流式细胞分析睾丸内细胞DNA含量显示,纯合敲除小鼠睾丸内单倍体细胞比例下降,二倍体和四倍体比例明显上升,对照小鼠睾丸内二倍体和四倍体比例较低。与组化结果及流式结果一致,生育力测试显示Dicer1纯合敲除小鼠仍有部分生育力,可以产生存活后代,但后代数量显著少于对照雄鼠。PP2ACα在精原细胞和减数分裂前敲除产生的表型与Dicer1敲除的表型不同,纯合敲除PP2ACα的小鼠睾丸相比Dicer1敲除睾丸重量体积减少较少,并且管腔内并没有产生严重的空泡化现象,但大部分管腔缺乏通过减数分裂的圆形精细胞和伸长的精细胞,仅有精原细胞和精母细胞存在,在附睾内可以见到大量的颗粒状脱落细胞,精子数量远少于对照小鼠附睾内精子数量,杂合敲除小鼠同样没有明显表型,曲细管腔及附睾内精子发生都与野生型无明显差别。Western-blot结果显示纯合敲除小鼠睾丸内PP2AC蛋白含量显著降低;Tunel结果显示P15天开始纯合小鼠睾丸曲细精管内凋亡细胞已有增多,明显多于对照小鼠。流式细胞分析睾丸内细胞DNA含量显示,纯合敲除小鼠睾丸内单倍体细胞减少了25%,二倍体和四倍体比例则明显上升。初步的生育力测试显示PP2ACα敲除小鼠丧失生育力,不能产生存活后代。结论:减数分裂是发生转录后调控的重要环节,减数分裂的异常会影响到精子发生进程。Dicer1和miRNAs是精子发生和减数分裂正常进行必须的,在减数分裂前期敲除Dicer1会导致精子发生缺陷。同样影响到有丝分裂和减数分裂过程的PP2A被敲除也会引起精子发生障碍。