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猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia,PCP）是一种由猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的接触性呼吸道传染病,并且在实际临床诊断工作中发现,本病极易与猪蓝耳病、猪副嗜血杆菌病等多种疫病混合感染发生,可导致养殖场出现较高的疫病防控风险和巨大的经济损失,是养猪业常见、多发的主要传染病之一。本研究基于2020年11月贵州毕节市某养猪场发生的一起整栋圈舍后备母猪发生呼吸困难症状,并出现急性型死亡的病例。通过对养殖场的免疫程序、饲养管理、引种调运、临床症状、病理解剖等情况的了解,初步怀疑为猪传染性胸膜肺炎。论文开展了以下研究,为临床防控该病提供科学依据。1.猪胸膜肺炎放线杆菌的分离、鉴定（1）病理剖解结果。经现场剖检病死猪,发现病死猪心包内有积液,心脏表面有大量纤维素性渗出物覆盖,呈现典型“绒毛心”病变,肺脏充血肿大,肺叶高度硬化,内有大量白色泡沫状粘液,肝脏充血肿大且表面有散在出血点。（2）APP分离与镜检结果。经分离培养,在巧克力琼脂培养基与血琼脂培养基上均长出与猪胸膜肺炎放线杆菌形态相符的白色、边缘粘液状、微隆起的圆形菌落,且在血琼脂培养基上呈现溶血现象;筛选分离菌菌落、染色镜检,观察到分离菌为革兰氏阴性短小球状杆菌。（3）生化试验结果。对纯培养的分离菌进行生化试验鉴定,结果可以观察到分离菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、木糖等糖类,但不能发酵乳糖、甘露醇、山梨醇等糖（醇）,MR试验呈阳性吲哚试验、硫化氢试验呈阴性,基本符合猪胸膜肺炎放线杆菌的生化特性。（4）病原核酸PCR鉴定结果。通过设计合成猪胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体与副猪嗜血杆菌的特异性引物,对采集的肺脏组织进行病原核酸检测试验,结果显示,对应猪胸膜肺炎放线杆菌约430 bp处出现特异性扩增条带,与该菌的引物预扩增片段大小相符,检测结果为阳性;而对应猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌处均无扩增条带显示,检测结果为阴性,表明待检病料中确实只存在胸膜肺炎放线杆菌。（5）分离菌16s rRNA分析结果。采用16s rRNA特异引物对分离菌进行PCR检测,PCR产物经测序与比对分析发现:分离菌16s rRNA扩增片段大小为1 403 bp,与预扩增片段大小相符,分离菌与猪胸膜肺炎放线杆菌的同源性均在99%以上。依据序列同源性≥99%可鉴定到菌种的标准,鉴定分离菌为猪胸膜肺炎放线杆菌,并将此分离菌株命名为APP BJ2020株。（6）分离菌生物型鉴定结果。采用普通大豆酪蛋白琼脂培养基（仅添加有5%胎牛血清）和改良大豆酪蛋白琼脂培养基（添加有5%胎牛血清和0.01%烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）分别接种培养分离菌,经培养对比结果发现,分离菌株在改良大豆酪蛋白琼脂培养基上生长良好,表现出烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性,将其确定为生物I型菌株。2.猪胸膜肺炎放线杆菌BJ2020株的致病性研究（1）分离菌血清型鉴定结果。对分离菌进行扩大培养后,制备DNA模板,设计、合成8种国内常见血清型的特异性引物进行PCR检测,血清型条带扩增大小略高于1 000 bp,与血清5型引物预扩增片段大小相符,由此可证明本试验分离的APP BJ2020株为血清5型。（2）分离菌Apx毒素鉴定结果。分别设计、合成Apx I、Apx II、ApxⅢ、ApxⅣ四种毒素基因引物,进行Apx毒素基因PCR检测,结果对应Apx I、ApxⅢ及ApxⅣ出现扩增条带,基因片段扩增大小与预扩增基因片段大小514bp、320 bp、634 bp基本一致,证明分离菌携带有Apx I、ApxⅢ及ApxⅣ三种Apx毒素。（3）分离菌溶血基因鉴定结果。参照不同参考菌株的hla、hlb、hld、hlg、hlg-2溶血基因片段合成引物,进行溶血基因PCR检测,结果没有扩增出对应hla、hlb、hld、hlg、hlg-2等溶血基因片段的特异性条带,说明分离菌未携带上述5种类型的溶血基因。（4）分离菌药敏试验结果。选取药敏纸片通过K-B法测定分离菌株的耐药性,记录分离菌对不同种类药物产生的抑菌圈大小,结果为:分离菌对青霉素、头孢哌酮、克林霉素、诺氟沙星、复方新诺明等9种药物敏感,对头孢氨苄、米诺环素中度敏感,对羧苄西林耐药、庆大霉素、红霉素、万古霉素、四环素等9种药物耐药。（5）分离菌耐药基因鉴定结果。结合药敏试验中分离菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类等药物产生耐药的试验结果,针对tem、ctx-m、ant2-Ⅰa、aac3-Ⅱc、hlb、clfa、gyr B、par C、par E、oqx A、omp F等基因设计引物进行耐药基因PCR检测,结果显示分离菌在对应tem、gyr B、par C和par E四种耐药基因处显示特异性扩增条带,扩增出大小约293 bp、448 bp、417 bp、483 bp的目的片段,与对应基因的预扩增大小相符,由此判定分离菌携带有tem、gyr B、par C和par E四种耐药基因。（6）分离菌动物感染结果。选取小鼠设置对照及试验组,对试验组注射菌液后,记录各组小鼠生活状态和死亡情况,分析APP BJ2020株的致病性。结果显示试验组小鼠在注射菌液（1.65×108 CFU/m L）4 h后,精神焦躁而后萎靡不振,食欲减退至废绝,5只小鼠先后在24～72 h内全部死亡,剖检可见心脏充血肿大、有血色心包积液、肺脏肿胀且有散在出血点、肺脏尖叶与胸膜粘连、肝异常肿大且有针尖大小出血点、肠壁及内容物呈明黄色胶冻状。致病性试验表明从发病小鼠体内分离到的细菌生长形态、染色特性、血清型与接种的分离菌一致,证明APP BJ2020株具有较强的致病性。通过以上对APP BJ2020株开展的一系列病原生物学特性研究,掌握该养殖场致病猪胸膜肺炎放线杆菌的相关特性,为该场科学有效地开展猪传染性胸膜肺炎的防治工作,提供了有力的科学依据。