论文部分内容阅读
目的 髓内残留病变是急性白血病缓解后复发的根源。但是，来源于骨髓基质的信号如何影响髓内残留白血病细胞，其机制目前还不清楚。近年来研究发现，基质细胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1, SDF-1）是骨髓基质细胞生成、分泌的一种重要的趋化因子，其唯一的受体CXCR4在造血干细胞和白血病细胞表面有不同程度的表达，二者的结合在白血病细胞的移动、生存和凋亡以及造血干细胞动员和归巢等方面发挥极其重要的作用。因此，通过干预SDF-1／CXCR4系统能否影响白血病细胞在骨髓内的生存、增殖及凋亡，同时白血病骨髓内白血病细胞对化疗药物的敏感性是否发生改变，如何变化等问题，目前国内外尚缺乏系统性研究。本实验通过研究SDF-1／CXCR4系统与白血病细胞之间的关系，进一步认识微小残留病变的形成机制，并为寻找通过改造白血病骨髓微环境逆转细胞耐药治疗白血病的新的治疗方法提供理论基础。 方法 本实验中，收集13例正常及14例白血病骨髓标本，分离骨髓单个核细胞，采用Dexter型贴壁细胞长期培养体系培养骨髓基质细胞，待基质细胞融合成层后，与急性髓细胞白血病细胞株HL-60细胞共培养。本研究分成实验组与对照组，对照组只加入等量培养液，实验组加入10μg／ml抗CXCR4的单克隆抗体12G5以阻断SDF-1的生物学作用，12G5加入时间与共培养时间一致，在不同时相点检测下述指标。（1）流式细胞仪检测HL-60细胞膜表面CXCR4的表达。（2）ELISA法检测骨髓基质细胞培养上清中SDF-1的含量。（3）倒置显微镜下观察HL-60细胞在骨髓基质层上的粘附情况并计算粘附率。（4）台盼蓝排染法测定HL-60细胞的存活率并绘制细胞生长曲线。（5）流式细胞仪测定HL-60细胞增殖周期及凋亡率。（6）免疫组织化学染色检测HL-60细胞原癌基因BCL-2、凋亡基因Fas及细胞增殖核抗原PCNA的表达。（7）培养体系中加入不同浓度化疗药物孵育，MTT染色，分光光度计测定不同时相点A540值，绘制药物杀伤效应曲线，同时在形态学上观察化疗药物Ara-C对HL-60细胞杀伤效应的变化。 结果 主要实验结果如下： （1）HL-60细胞膜表面有中等程度的CXCR4表达。培养体系中加入10μg／ml 12G5孵育后，在观察周期内，随着孵育时间延长，HL-60细胞膜表面的CXCR4表达逐渐下第三军医大学硕士学位论文降，各时相点均明显低于孵育前（P<0.05）。 （2）ELISA检测结果显示，白血病基质细胞培养上清中SDF一1的平均含量为（294 1 .483士374.671）p岁而，而正常基质细胞培养上清中SDF一l的含量为（1534.713士295.198）pg/而，明显低于前者（p<0.05）。 （3）12GS对HL一60细胞粘附特性的影响:①形态学结果:共培养Zh后，在正常基质共培养体系中，对照组可见散在HL一60细胞粘附于基质层上，而加入ro“岁nil 12G5孵育后，基质层上未见细胞粘附;在白血病基质共培养体系中，对照组中附着于基质层的白血病细胞明显多于实验组。②粘附率:共培养24h后在正常基质共培养体系中，对照组中骨髓基质对HL一60的粘附率为（4 8.7士5.3）%，而实验组仅为（19.1士8.6）%，明显低于前者（P<0.05）。在白血病基质共培养体系中，对照组HL一60细胞的粘附率为（51.4士5.9）%，实验组为（39.4士7.9）%，显示12GS可显著降低白血病骨髓基质细胞对HL一60细胞的粘附率（P<0 .05）。比较不同基质细胞对HL一60细胞的粘附率，在对照组中，白血病基质对HL一60细胞的粘附率略高于正常基质，但统计学结果显示二者无明显差异（P>0 .05）。 （4）HL一60细胞存活率的变化。加入12GS孵育0、24、48、72、96h后，台盼兰染色结果显示:①正常骨髓基质共培养体系中HL一60活细胞比例分别为（95.5士2.9）%、（8 2.3士3.1）%、（7 5.5士2.5）%、（7 2.4士4.4）%和（6 9.2士3.6）%。②白血病基质共培养体系中HL一60活细胞比例分别为（98.1士1.0）%、（90.4士0.9）%、（52.7土3.4）%、（79.8士0.6）%和（81.5士2.7）%。从HL一60细胞生长曲线可以观察到，随着12G5孵育时间延长，HL一60细胞增殖活性明显受抑。 （5）12G5孵育24h后，正常及白血病骨髓基质共培养体系中，处于G夕GI期的HL一60细胞比例分别为（54.71士6.4）%和（55.21士4.9）%，明显高于对照组（分别为43.52士5.9%和44.67士2.2%）（尸<0.05）;相反，实验组中处于S期的HL一60细胞比例分别为（38.37士4.5）%和（30.40土4.1）%，较前者明显降低（平均为43.86士3.0%和45.30士3.7%）（尸<0.05）。12GS孵育24h后，正常及白血病骨髓基质共培养体系中HL一60细胞凋亡率分别为（11.51土2.9）%和（8.95士1.7）%，显著高于对照组（分别为5.47士1.4%和3.97士2.4%）（P<0.05）。 （6）1205孵育24h后，Bel一z及PCNA蛋白表达阳性率分别为（25.7士4.9）%和（42一士3.9）%，显著低于对照组（分别为3一6士5.2%和67.4士8.5%）（P<0.05），而12G5孵育24h后Fas蛋白表达阳性率为（39.7士7.5）%，明显高于对照组（24.1士6.7）%，尸<0 .05。观察Bel一2、Fas及PCNA染色阳性细胞，12G5孵育后，Bel一2、PCNA染色变浅，而Fas染色增强。第三军医大学硕士学位论文 （7）12GS对HL一60细胞药物反应性的影响。①从药物杀伤效应曲线观察到，在20林岁nil Ara一C组，对照组中前2天As40值?