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丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一组可被多种信号激活的丝/苏氨酸蛋白激酶。经磷酸化活化的丝裂原活化蛋白激酶,可参与多种细胞生命活动,如调节基因转录,诱导细胞凋亡、调节细胞周期等。MAPK诱导细胞凋亡的作用,尤其是诱导肿瘤细胞凋亡的作用,已成为人们关注的焦点。现已发现p38,ERK5,ERK以及JNK 4个亚族。其中ERK,JNK,p38MAPK三条通路与肿瘤细胞凋亡关系密切。JNK信号通路是MAPK中重要的通路之一。最近的研究表明,JNK通路的激活与促凋亡作用有关。活化的JNK通过磷酸化c-Jun和ATF2激活转录因子AP1,结果导致FasL表达增强,促进细胞凋亡。JNK介导细胞凋亡的另一途径是通过磷酸化Bc1-2和Bc1-xL,而后促进线粒体释放细胞色素c,从而激活Caspase级联反应,导致细胞凋亡。GCK分子属于Ser/Thr蛋白激酶,有研究表明GCK分子参与了JNK信号通路,且表达外源性的GCK分子可以在细胞内活化JNK。而通过RNAi技术沉默gck基因可以阻断LPS和UV刺激活化JNK的信号通路。但是GCK分子具体如何调控JNK信号通路尚待探讨。因此本文通过克隆GCK基因和构建转基因细胞,继而初步观察了紫外线照射对促进UV诱导细胞凋亡的作用机制。论文共分为两部分。1人GCK基因克隆及其转基因细胞的构建目的克隆人GCK基因,并构建含有该目的基因的pIRES2-EGFP-GCK重组质粒载体,并获得稳定表达GCK分子的GCK-HEK293转基因细胞。方法以pCMV5-GCK质粒为模板,PCR法获得gck基因,将其装入pIRES2-EGFP质粒载体中,脂质体法共转染HEK293细胞,用G418筛选出能稳定表达GCK蛋白的GCK-HEK293转基因细胞株。结果成功构建了pIRES2-EGFP-GCK质粒载体,并建立了稳定表达人GCK蛋白的GCK-HEK293转基因细胞株。结论构建了含人GCK基因的重组pIRES2-EGFP-GCK质粒载体和稳定表达人GCK蛋白的GCK-HEK293转基因细胞株,为该基因功能的后续研究奠定基础。2 GCK分子对促进UV诱导HEK293细胞凋亡的研究目的研究GCK分子促进UV诱导HEK293细胞凋亡的信号转导机制。方法分别选取GCK-HEK293转基因细胞、pIRES2-HEK293转基因细胞、HEK293细胞2×105个细胞接种于6孔板中,培养12h后,进行不同时间的UV照射。2min、4min、5min、6min。继续培养24h。离心收集细胞,PI染色1min,利用流式细胞术检测细胞的死亡率。UV照射HEK293,5min,24h后,裂解细胞,收集上清检测GCK分子的表达。结果1.经过不同时间UV的照射,在24h后,GCK-HEK293转基因细胞与pIRES2-HEK29转基因细胞和HEK293相比,细胞的死亡率显著上升,而pIRES2-HEK29转基因细胞和HEK293细胞的死亡率相比差别不显著。2.UV能诱导HEK293细胞内源性表达GCK分子。结论GCK分子具有促进UV诱导HEK293细胞的凋亡。