【摘 要】
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乳酸菌作为一种来源广泛且较为安全的微生物,因其良好的发酵性能和益生特性而被广泛应用于食品和药品行业中。乳酸菌作为发酵剂直接加入乳制品、肉制品中不仅能够有效促进发酵过程的进行,提高食品品质,还能在一定程度上抑制发酵过程中其他腐败微生物的污染。乳酸菌的抑菌范围主要包括与其亲缘关系较近的革兰氏阳性细菌,对酵母、霉菌等的抑制效果较弱。研究也发现有部分乳酸菌具有较为广谱的抑菌效果,但总体数量较少,因此筛选更
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（31972126）； 重庆市自然科学基金面上项目（cstc2019jcyj-msxm X0357）；
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乳酸菌作为一种来源广泛且较为安全的微生物,因其良好的发酵性能和益生特性而被广泛应用于食品和药品行业中。乳酸菌作为发酵剂直接加入乳制品、肉制品中不仅能够有效促进发酵过程的进行,提高食品品质,还能在一定程度上抑制发酵过程中其他腐败微生物的污染。乳酸菌的抑菌范围主要包括与其亲缘关系较近的革兰氏阳性细菌,对酵母、霉菌等的抑制效果较弱。研究也发现有部分乳酸菌具有较为广谱的抑菌效果,但总体数量较少,因此筛选更多具有广谱抑菌效果的乳酸菌,扩充菌库,对其以后的开发和应用具有重要的意义。乳酸菌的抑菌作用主要来源于其在生长繁殖过程中分泌的各种代谢产物,如有机酸、过氧化氢和一些蛋白类物质（细菌素、环二肽等等）。不同菌株其抑菌活性也会存在一定的差异,明确各菌株的抑菌特性将有利于对其的研究和利用。随着化学杀菌剂的使用逐渐受到限制,细菌素作为一种新型、安全的抑菌物质引起了广泛的关注。细菌素主要存在于乳酸菌的发酵液中,由于发酵液成分复杂且细菌素的含量较低,通过传统的分离纯化方式获得细菌素样品较为复杂和繁琐,耗时耗力且得率低,难以用于后续的研究。采用异源表达这一方法则很好的避免了这一系列问题,其中大肠杆菌表达系统则是最为普遍使用的表达系统。该方法不仅可以有效降低微生物的培养成本,还能快速获得较多的细菌素样品。而细菌素的抑菌机理主要是作用于微生物的细胞膜,通过改变细胞膜的通透性,形成通道或孔洞,引起胞内物质外泄,干扰细胞正常的生理代谢,从而引起微生物的死亡。本文主要从叶片、果实和土壤等样品中筛选能够有效抑制Penicillium digitatum和Staphylococcus aureus的乳酸菌,通过离体和果实实验明确其无菌发酵液的抑菌特性,并通过对Lactobacillus sucicola JT03细菌素的异源表达初步明确其抑菌机理。主要研究结果如下:（1）从柑橘叶片、果实、柑橘园土壤和花生叶片中的共筛选到68株乳酸菌,其中16株来自柑橘果实表面,6株来自柑橘叶片,24株来自柑橘果园土壤,还有22株来自花生叶片。通过离体实验共筛选出10株对P.digitatum和S.aureus均具有抑菌效果的乳酸菌,经16S r DNA鉴定后分别属于:Weissella paramesenteroides、Pediococcus acidilactici和L.sucicola;（2）通过离体抑菌实验发现L.sucicola JT03、W.paramesenteroides JT13和P.acidilactici JY03的无菌发酵液对P.digitatum、Escherichia coli和S.aureus均具有一定的抑菌能力,进一步通过柑橘果实接种实验发现三株乳酸菌的无菌发酵液也能够有效控制柑橘果实绿霉病的发生和病斑扩展;（3）L.sucicola JT03、W.paramesenteroides JT13和P.acidilactici JY03的无菌发酵液经酸碱中和处理和过氧化氢酶处理后其抑菌活性变化不太明显,但是经胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶处理后其抑菌活性发生了明显的变化。特别的是,经胰蛋白酶处理后,三株乳酸菌无菌发酵液的抑菌活性均完全丧失,因此推测三株乳酸菌无菌发酵液中主要的抑菌物质可能为蛋白类物质,初步确定为细菌素;（4）通过大肠杆菌异源表达系统成功表达出由L.sucicola JT03全基因组测序鉴定到的两个细菌素（bacteriocin 63和bacteriocin 90）,表达出的细菌素具有较高的抑菌活性,可以抑制多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌;（5）Bacteriocin 63和bacteriocin 90的MIC分别为10 AU/m L和20 AU/m L。通过杀菌动力学曲线和扫描电镜观察,发现两个细菌素均能够在短时间内通过改变S.aureus的细胞形态,在其表面形成褶皱或孔洞,发挥出强烈的杀菌作用。综上所述,本文从自然环境中筛选出了3株具有较高抑菌活性的乳酸菌,通过柑橘果实实验和离体实验明确了其无菌发酵液的抑菌特性,并初步探讨了L.sucicola JT03细菌素的抑菌机理。
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