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目的 利用数据非依赖采集（Data independent acquisition,DIA）质谱定量技术筛选肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）早期诊断蛋白标志物。通过GO（Gene ontology）和PPI（Protein-protein interaction network）分析探讨生物标志物与肝癌发生发展机制之间联系,并使用平行反应监测（Parallel reaction monitoring,PRM）质谱靶向定量技术评估和验证HCC血清早诊标志物效能。方法1.利用高效液相色谱（High performance liquid chromatography,HPLC）联合MARSHuman14抗体柱对320例血清样本混合而成的8个Pool进行高、低丰度蛋白分离,经聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）及无标记定量（Label-free quantification）蛋白质组方法评估高、低丰度蛋白分离效果。超高效液相色谱（Ultra performance liquid chromatography,UPLC）继续细化血清高、低丰度蛋白馏分,并以数据依赖采集（Data dependent acquisition,DDA）模式采集Pool样本质谱数据。320例血清样本制备肽段样品直接利用DIA模式采集质谱数据。整合DDA与DIA数据生成HCC血清蛋白质谱数据库。2.320例血清DIA质谱数据匹配生成的HCC血清蛋白质谱数据库,获得血清蛋白质组学数据。以P值<0.05,差异倍数（Fold change,FC）≥1.2或≤0.83为阈值筛选HCC血清差异蛋白,并利用时间序列表达模式聚类分析从差异蛋白中挑选符合HCC早诊变化趋势的候选标志物。通过GO和PPI分析探讨候选生物标志物与肝癌发生发展机制之间的相关联系。利用随机森林模型重要性和受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）评估候选标志物ADGRG6和优化标志物panel的效能。3.通过PRM技术对75例验证队列血清中ADGRG6的浓度进行靶向定量,利用ROC检验ADGRG6诊断HCC的曲线下面积（Area under curve,AUC）、灵敏性和特异性,并在甲胎蛋白（Alpha fetoprotein,AFP）阴性HCC中检验其诊断效能,进一步评估ADGRG6联合AFP诊断HCC的效能。结果1.SDS-PAGE显示经MARS-Human14抗体柱分离出的低丰度蛋白条带颜色加深,Label-free质谱分析显示低丰度蛋白丰度提高,蛋白鉴定数目得到提升;整合生成的血清蛋白质谱数据库包含875个蛋白,质量良好,符合血清蛋白性质与分布,其中有123个未在血浆蛋白数据库（Plasma proteome database,PPD）中被报道。2.320例血清样本共可鉴定血清蛋白450个,HCC中存在差异蛋白34个,其中22个蛋白符合HCC早诊标志物变化趋势。GO和PPI分析显示早诊候选标志物主要同HCC在免疫和代谢调控功能相关。利用ROC进行评估,ADGRG6诊断HCC的AUC为0.8398,灵敏度为0.7975,特异度为0.8344。在AFP阴性样本中诊断HCC的AUC为0.8210,灵敏度为0.8221,特异度为0.8854。在异常凝血酶原（Protein induced by Vitamin K absence or antagonist-II,DCP）阴性样本中诊断HCC的AUC为0.8056,灵敏度为0.8000,特异度为0.8880。ADGRG6联合临床AFP和DCP后AUC达到0.9594,灵敏度为0.9877,特异度为0.8153,对HCC具有良好的诊断效能。利用随机森林（Randomforest）机器学习模型可将HCC早诊标志物panel优化至6个蛋白组合,预测AUC为0.990,灵敏度为0.980,特异度为0.957,具有良好的HCC预测效能。标志物panel对AFP阴性和DCP阴性样本也能有效预测。3.经PRM靶向定量验证,ADGRG6在HCC血清中的浓度显著升高,ADGRG6诊断HCC的AUC为0.7606,灵敏度为0.8980,特异性为0.5385,是HCC血清潜在的标志物。ADGRG6联合临床AFP后进行诊断的AUC为0.9030,灵敏度为0.7708,特异度为0.9231,联合诊断可以提升诊断HCC的效能。结论1.MARS-Human14抗体柱联合超高效液相色谱（UPLC）分离血清蛋白馏分策略能够高效构建血清蛋白质谱数据库。2.构建了HCC血清蛋白质组表达谱,筛选出ADGRG6和6个蛋白组成的panel具有良好的HCC诊断效能。3.ADGRG6在HCC血清中的浓度显著升高,是HCC血清中的潜在早诊生物标志物,联合AFP可以有效提升其诊断效能。