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本课题以乳清蛋白为研究对象,利用蛋白酶酶解乳清蛋白,制备乳清蛋白肽-钙螯合物,对其进行理化分析及结构表征,并对乳清蛋白肽-钙螯合物体外生物活性进行测定;建立细胞吸收模型,从细胞水平研究乳清蛋白肽-钙螯合物的促钙吸收活性;通过连续色谱、质谱等手段分离出强钙螯合活性的特异性钙螯合肽,并进行结构性质鉴定;利用红外光谱、荧光光谱、原子力显微镜、核磁共振等技术结合量子化学计算方法,阐明肽钙螯合机理。1.确定酶解乳清蛋白最适用酶为复合蛋白酶和复合风味蛋白酶,采用响应面中心组合实验法优化出复配酶酶解乳清蛋白的最适条件为:底物浓度为5%(w:v),pH7.0,酶底比4.0%(w:w)、温度49℃、酶的复配比2:1(复合蛋白酶:复合风味蛋白酶,w:w)、酶解时间7h,此时乳清蛋白的水解度为25.92%。2.以螯合率为指标,采用响应面中心组合实验法对乳清蛋白肽与氯化钙的螯合工艺进行优化,确定乳清蛋白螯合钙的制备条件为:以液体钙的形式添加,乳清蛋白肽与氯化钙质量比24:1(w:w),乳清蛋白肽浓度3.5%(w:v),反应时间20min,反应温度30℃,pH7.5,此时螯合率达92.56±1.70%。3.对乳清蛋白肽-钙螯合物的理化性质和结构进行研究。通过定性检测、成分分析、溶解度测定等,确定乳清蛋白肽-钙螯合物是一种富含多肽和钙,具有一定抗氧化能力,且在不同pH的水溶液中有较好的溶解性、乳化性和稳定的钙离子释放率的多肽螯合物。经过紫外扫描、红外光谱、荧光光谱及XRD分析对其结构进行测定,证明乳清蛋白肽-钙螯合物与乳清蛋白、氯化钙不同,是一种新型螯合物。经粒度分析、原子力显微镜分子形貌分析和核磁共振氢谱分析可知,在整合的过程中乳清蛋白肽发生聚合作用,分子量变大,形成结构更加紧密的螯合物。4.建立细胞模型,利用MTT法测定在浓度在0-15mmol/L范围内乳清蛋白肽-钙螯合物对Caco-2细胞增殖无显著影响。在15mmol/L的浓度下,乳清蛋白肽-钙螯合物组的钙离子摄取量显著高于氯化钙和葡萄糖酸钙对照组。5.采用常压离子交换色谱、常压凝胶过滤色谱、反向高效液相色谱对乳清蛋白肽进行分离纯化,得到4个具有高钙结合活性的特异性钙螯合肽,分别命名为WPH-1、WPH-2a、WPH-2b 和 WPH-3。经 LC-MS/MS 鉴定,其氨基酸序列分别为 Glu-Gly(EG)、Phe-Aap(FD)、Gly-Tyr(GY)和Tyr-Asp-Thr(YDT)。纯化得到的特异性钙螯合肽 WPH-1、WPH-2、WPH-3的钙离子螯合活性分别为67.81 μg/mg、73.34 μg/mg、79.51μg/mg,与未纯化的乳清蛋白肽相比,体外钙螯合活性分别提高了 95%、116%、134%。特异性钙螯合肽-钙螯合物在pH2.0到pH8.0不同条件下的钙离子释放率较稳定,在肠道pH 7.2的弱碱性环境下仍可溶,易被肠道上皮细胞吸收转运。6.采用紫外光谱、红外光谱、荧光光谱、核磁共振、XR]D、DSC和Zeta电位等方法对肽与钙离子的螯合机理进行研究,以谷氨酸-甘氨酸(EG)和酪氨酸-天冬氨酸-苏氨酸(YDT)为研究对象,运用量子化学计算对其化学结构进行分子模拟,得到稳定的优势构象,研究了与钙离子的键合方式,得到肽钙螯合的机理:钙离子与肽中的羰基氧原子和竣基氧原子发生配位,同时也可与酰胺键上的氮原子之间产生配位键,并导致与O原子和N原子相近原子的电荷发生变化,从而引起整个分子电荷重新分布,导致肽的空间结构发生改变,形成一种新的肽-钙螯合物。