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炎症本身是机体对外源或内源有害刺激的一种防御机制,也是多细胞多因素参与调控的固有免疫反应。但过度的炎症反应则会加重损伤,导致机体的二次伤害。目前公认的两种激活体内炎症反应的方式有:病原相关分子模式（PAMP）与损伤相关分子模式（DAMP）。G蛋白偶联受体（GPCR）是机体内广泛分布,细胞表面表达最多的感受外界刺激的受体家族之一。本课题组前期对两大类的GPCR受体——Gαs类的腺苷A2A受体（A2AR）及Gαq/11类的代谢型谷氨酸受体5（mGluR5）在炎症反应中的作用进行初探,发现A2AR与mGluR5均参与了PAMP和DAMP介导的炎症反应,但具体机制还有待阐明。因此本文聚焦到炎症调控的一线免疫细胞——中性粒细胞,关注这两类GPCR（A2AR与mGluR5）是如何在PAMP及DAMP相关炎症反应中调控中性粒细胞功能及相关分子机制,以期发现调控炎症及相关疾病的新机制与新靶点。第一部分:A2AR和mGluR5在PAMP炎症模型中的作用1.在LPS诱导小鼠的全身炎症反应（SIRS）中,我们发现A2AR敲除小鼠的死亡率明显高于野生型小鼠,伴随着促炎因子释放增强和中性粒细胞的过度凋亡。通过流式细胞及WB分析证实:A2AR敲除组内中性粒细胞的自噬水平明显升高,过度自噬导致中性粒细胞过度凋亡。激活中性粒细胞表面的A2AR,一方面可以通过激活PKA通路抑制炎症介质的释放,另一方面可以抑制ROS-JNK通路和促进β?-AKT通路,从而抑制中性粒细胞自噬依赖性凋亡,防止过度凋亡的中性粒细胞引发的炎症风暴。2.在LPS诱导的炎症相关的抑郁模型中,我们发现mGluR5敲除小鼠的抑郁行为明显得到改善,并伴随炎症介质水平的降低和脑内皮细胞的活化减少。随后我们利用骨髓移植的方法选择性敲除及重建骨髓来源细胞的mGluR5证实,mGluR5缺失的骨髓细胞也可明显抑制促炎介质的释放和脑内皮细胞的活化。进一步基因芯片筛查得出,mGluR5缺失的中性粒细胞内炎症因子及趋化因子的mRNA水平明显低于野生型小鼠,伴有PKC相关通路分子的明显下调。激活中性粒细胞表面的mGluR5通过增强PLC-PKC通路促进中性粒细胞炎症因子的释放;同时中性粒细胞释放的促炎因子通过激活血管内皮细胞内ERK通路,加强脑内皮细胞的活化,从而增强了中性粒细胞的粘附和浸润,加重了颅内炎症反应。本部分研究结果表明:在LPS诱导的急性炎症反应中（PAMP模型）,中性粒细胞表面A2AR（Gαs型）与mGluR5(Gαq/11型)发挥相反的调控作用,激活其表面的A2AR或拮抗mGluR5均可呈现抑炎保护效应。第二部分:A2AR和mGluR5在DAMP炎症模型中的作用1.我们以中度颅脑创伤为模型,发现颅脑创伤后的脑组织内A2AR-mGluR5复合体明显升高。本课题组前期研究证实高浓度的谷氨酸可以促进中性粒细胞表面A2AR-mGluR5复合体的形成,并加重炎症相关损伤。我们通过离体细胞模型证实该复合体的形成和功能具有细胞特异性:高浓度的谷氨酸可以增加中性粒细胞表面的A2AR-mGluR5复合体的形成,促进中性粒细胞过度释放炎症介质;但高浓度的谷氨酸却抑制神经元表面A2AR-mGluR5复合体的形成,加重神经元的损伤。我们通过构建A2AR蛋白突变质粒及免疫共沉淀实验证实,A2AR胞内第三肽段（A2AR C3）为决定神经元表面A2AR-mGluR5复合体是否形成的重要片段。离体原代神经元过表达A2ARC3突变质粒组内,A2AR-mGluR5复合体形成明显降低,伴随乳酸脱氢酶明显升高;过表达野生型A2AR质粒,A2AR-mGluR5复合体明显增多,并伴随乳酸脱氢酶明显降低,证实A2AR-mGluR5复合体的形成对神经元的保护作用。2.我们进一步发现在颅脑创伤模型中,A2AR-mGluR5复合体可在异种细胞间（中性粒细胞与神经元）形成:利用Z-dock蛋白质分子对接软件分析,表明A2AR与mGluR5具有实现胞外区氨基酸位点的基础;在谷氨酸诱导的共培养体系中（A2AR缺失的神经元及mGluR5缺失的中性粒细胞）,离体证实异种细胞间A2AR-mGluR5复合体的形成;通过构建嵌合小鼠（脑组织A2AR敲除合并骨髓细胞mGluR5敲除）颅脑损伤模型,在体证实异种细胞间A2AR-mGluR5复合体的形成,并且明显抑制了损伤后恢复。在上述共培养的中性粒细胞与神经元体系中,借助基因芯片筛选了与异源A2AR-mGluR5复合体相关,并特异性表达在神经元的目标基因,结合在体实验证实异源A2AR-mGluR5复合体通过下调神经元内神经粘连因子（NRP1）及蛋白磷酸酶调节亚基12A（PPP1R12）,从而抑制了神经元的修复。本部分研究结果表明:在急性颅脑创伤诱导的炎症反应中（DAMP模型）,中性粒细胞表面与神经元表面可分别形成A2AR-mGluR5二聚体（同源复合体）,二聚体的形成一方面促进中性粒细胞炎症介质的释放,另一方面防止神经元过度损伤;同时颅脑创伤后,损伤脑组织处的谷氨酸可以诱导浸润的中性粒细胞与神经元形成A2AR-mGluR5二聚体（异源复合体）,并下调神经元内NRP1及PPP1R12的水平,从而抑制神经元修复。