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背景和目的甲状腺功能亢进性周期性麻痹(Thytotoxic periodic paralysis，TPP)是一种与钾离子代谢紊乱相关的疾病。本病多发于亚洲男性，男女发病率比高达70:1。而罕见于西方人群，这种显著的地域差异性和性别差异性提示遗传因素在本病的发生中起着重要作用。虽然科学家们做了大量的研究工作，但本病的发病机理至今不明，以往的研究已排除了与家族性低钾性周期性麻痹(Familial hypokalemic periodic paralysis，FHPP)发病相关的基因，5种钠-钾-ATP酶基因及β2肾上腺素受体基因在该病中的作用。细胞膜钠-钾-氯离子共转运体1(Sodium-potassium-chloride cotransporter，NKCC1)广泛分布于包括骨骼肌在内的多种组织。在静息情况下，钾离子进入细胞的15％由NKCC1所介导，在骨骼肌收缩或儿茶酚胺刺激下，NKCC1介导的钾离子进入细胞占35％。由于骨骼肌细胞所含的钾离子是总体钾的75％，因而NKCC1可能在调节钾离子平衡方面起着一定的作用。此外，部分TPP患者存在着高肾素，血管紧张素Ⅱ和醛固酮水平。日本学者Kobori研究发现甲状腺激素可刺激肾素的表达，并在肾素基因的5’端发现了甲状腺激素反应元件。甲状腺激素与甲状腺激素受体(Thyroid Hormone Receptor,TR)结合，转位于核内在与甲状腺激素反应元件(Thyroid Hormone ResponseElements，TRE)而发挥作用，甲状腺激素反应元件由两个半单位组成，各结合一个受体单体。每个半位一般长6 bp，其共有序列为AGGTCA。由于TPP的发作和缓解与甲状腺功能密切相关：即甲亢时麻痹发作而甲状腺功能正常后大多数患者发作停止。因而我们推测TPP的发病可能与二种因素有关：1．钾离子进入细胞相关的基因及调节基因的启动子区域核苷酸突变，使TRE对甲状腺激素的反应增强，功能亢进，钾离子向细胞内转移增加，发生低钾血症，待甲状腺功能正常后低血钾发作停止。2．细胞钾离子外流相关的基因突变，使该基因功能减退，钾外流减少。如家族性周期性麻痹发病机理。本研究着眼于前者：即对钾离子进入细胞相关基因及调节基因的启动子区域核苷酸序列的分析。我们选NKCC1基因和肾素基因的5’区域核苷酸序列为我们研究的候选基因。通过研究TPP患者NKCC1基因和肾素基因5’端区域内邻近甲状腺激素反应元件部分有无有意义的突变和SNP，探讨TPP患者是否存在NKCC1基因和肾素基因突变。材料和方法1．研究对象：2003年6月-2006年5月在郑州大学第一附属医院内分泌科就诊的甲状腺功能亢进无周期性麻痹患者71例(甲亢病程＞6月或复发的甲亢患者)；甲状腺功能亢进性周期性麻痹患者56例(初诊的TPP患者及以往有低钾麻痹史的甲亢患者)及73例正常对照(无甲状腺功能异常，无自身免疫性疾病)。甲亢的诊断标准是临床表现结合血清FT3和(或)FT4升高，TSH低于正常。采取研究对象晨空腹抽抗凝血5ml，应用时间分辨免疫发光法测定血清FT3，FT4和TSH水平，常规生化法测定血电解质。同时通过询问病史或查阅病历获得56例TPP患者和71例单纯甲状腺功能亢进患者的临床特征。2．基因组DNA的提取：应用经典的苯酚—氯仿—异戊醇抽提法从研究对象的外周血中提取基因组DNA。3．拟扩增序列的确定和聚合酶链式反应(PCR)扩增：先利用网上启动子预测软件(Http://www.ucsc.edu/)和反应元件分析软件(Http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)分析NKCC1及肾素基因5’端区域核苷酸序列，找出启动子及甲状腺激素反应元件的位点。NKCC1扩增区域大小为1082bp，位于ATG前2199bp；肾素基因扩增区域大小为743bp，位于ATG前1238bp。再以基因组DNA为模板，PCR扩增NKCC1基因和肾素5’端区域内上述的目的片断。4．PCR产物的纯化和DNA测序分析：采用ExonucleaseⅠ(ExoⅠ)和虾碱性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP)法纯化PCR产物，并将纯化后的产物直接于ABI3700自动测序仪上测序，应用DNAMAN软件比对分析扩增区域与基因库中相关序列以发现是否存在与疾病发生相关的有意义的突变。5．统计学处理：计量资料统计描述采用均数±标准差，用两样本均数t检验分析，计数资料用率表示，率的差异比较采用x~2检验。所有统计数据分析采用SPSS10.0统计软件。以P＜0.05为差异有显著性。结果1．目的基因与甲亢周麻发生的关系甲亢组，甲亢周麻组及正常对照组肾素基因启动子区域内未发现突变及SNP，NKCC1基因5’端区域内邻近甲状腺激素反应元件部分也未发现有意义的突变及SNP。2．甲亢周麻患者与单纯甲亢患者临床特点的比较单纯甲亢组患者的发病年龄，体重和体重指数以及甲状腺功能与甲亢周麻组患者相比均无显著性差异；高代谢症候群发生率，甲状腺肿大的发生率和突眼的发生率都显著高于甲亢周麻组患者，而血清钾浓度显著低于甲亢周麻组患者。结论在NKCC1基因和肾素基因5’端序列邻近甲状腺激素反应元件部分没有发现与甲亢周麻患者发病相关的有意义的突变和SNP存在，甲亢周麻的发病机理有待我们进一步研究。