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第一章hTERT基因慢病毒表达载体的构建与鉴定[摘要]目的：构建及鉴定携带沉默人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)慢病毒表达载体,为进一步研究hTERT基因在宫颈癌中的作用机制奠定基础。方法：以Designer3.0 ( Genepharma)软件设计靶向hTERT基因特异性的小片段RNA (shRNA)干扰序列,将hTERT-shRNA基因片段插入重组慢病毒pGLV3/Hl/GFP+Puro,构建慢病毒表达质LV3-shRNA-hTERT,酶切、DNA测序验证hTERT片段准确性。LV3-shRNA-hTERT与包装质粒共转染293T细胞,浓缩上清液并测定病毒滴度获得重组慢病毒后感染caski细胞。将细胞分为空白对照组(未感染病毒的caski细胞)、阴性对照组(感染空载病毒LV3-shNC的caski细胞)和hTERT干扰组(感染携带LV3-shhTERT慢病毒的caski细胞)。绿色荧光蛋白(GFP)的表达判断转染结果并估计转染效率,流式细胞术仪检测病毒感染率,实时荧光定量PCR法检测转染后基因hTERT mRNA的表达量。结果：将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功；成功包装成高滴度的慢病毒,且能有效感染子宫颈癌caski细胞。荧光定量PCR检测结果证实构建的hTERT-小片段干扰RNA慢病毒表达载体感染caski细胞后hTERT基因的表达量显著低于空白组和对照组(P<0.01)。结论：成功构建了慢病毒表达载体LV3-siRNA-hTERT,能够有效感染宫颈癌caski细胞,并使hTERTmRNA的表达量明显降低,为进一步探讨hTERT基因在子宫颈癌的发病机制和体外基因干预治疗奠定基础。第二章hTERT基因对宫颈癌caski细胞生物学影响的体外研究[摘要]目的：探索宫颈癌caski细胞中hTERT基因表达下调之后对其生物学功能的影响。方法：CCK-8法检测三组细胞(NC、NC-LV、sihTERT-LV)的生长增殖情况,细胞平板克隆实验检测三组细胞的单克隆能力,采用流式细胞仪检测三组细胞周期及细胞凋亡情况。结果：si-hTERT-LV组细胞生长速度、单细胞克隆能力明显低于NC组及NC-LV组,差异有统计学意义(P均<0.05)。si-hTERT-LV组G1期细胞比率明显高于NC组和NC-LV组,差异有统计学意义(P均<0.05); si-hTERT-LV组S期细胞比率明显低于NC组和NC-LV组,差异有统计学意义(P均<0.05)。si-hTERT-LV细胞凋亡率明显高于NC-LV组和NC组,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论：宫颈癌caski细胞沉默了hTERT基因后,明显抑制细胞的生长,将细胞周期阻滞于GO/G1期,同时抑制其单克隆形成能力,增加细胞凋亡。