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HBV感染呈世界性流行，据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性HBV感染者。慢性HBV感染是引起肝硬化和肝癌的主要原因，每年全世界约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌HCC。肝脏疾病进展到肝硬化、肝癌等终末期肝病，常累及广泛的肝实质细胞受损，肝组织再生能力下降，造成肝功能失代偿，最终导致肝衰竭。肝衰竭是各种严重肝病的终末期表现，目前的治疗条件下，其病死率极高，寻找一种确切有效的治疗手段尤为重要。近年干细胞的研究在医学领域取得令人瞩目的成就，也为广大临床工作者开拓了新的思路，利用干细胞移植治疗终末期肝病成为新的热点。ADSCs因其与BM-MSCs形态相似亦被称为AD-MSCs。AD-MSCs具有多向分化潜能，不仅可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌肉细胞等中胚层间质组织细胞，还可以跨越胚层界限分化为外胚层的神经细胞及内胚层的肝细胞，另外AD-MSCs具有来源丰富、反复取材和较少涉及医学伦理学问题而倍受关注。本研究旨在建立乙型肝炎肝硬化患者皮下脂肪组织MSCs体外培养体系的基础上，探讨其生物学特性，并与乙型肝炎肝硬化患者骨髓来源MSCs的生物学特性进行比较，同时观察其体外增殖能力及向肝细胞分化的潜能，探讨高滴度HBV环境对其生物学特性的影响及AD-MSCs的体外HBV易感性，为AD-MSCs的基础研究和临床应用提供理论基础和技术平台。本研究采用胶原酶消化结合AD-MSCs的贴壁生长的特性分离培养乙型肝炎肝硬化患者皮下脂肪组织MSCs，建立AD-MSCs的体外培养体系，观察AD-MSCs的生物学特性，并与乙型肝炎肝硬化患者BM-MSCs的生物学特性进行比较；体外诱导AD-MSCs向肝细胞分化，观察细胞形态变化，免疫组织化学染色和Western blotting技术检测肝细胞系特异性标志物AFP、ALB和CK-18表达，过碘酸雪夫试剂染色检测细胞糖原合成功能，ELISA技术检测细胞白蛋白合成与分泌功能；采用高滴度HBV感染血清体外培养AD-MSCs，观察AD-MSCs生长状况和形态变化，免疫组织化学染色和Western blotting技术检测细胞内HBsAg和HBcAg表达，同时观察高滴度HBV环境对AD-MSCs成肝细胞分化的影响及AD-MSCs的体外HBV易感性。结果如下：1.15例乙型肝炎肝硬化患者AD-MSCs的体外培养成功率为100%（15/15），11例乙型肝炎肝硬化患者骨髓MSCs的体外培养成功率为63.6%（7/11）（P<0.05）；AD-MSCs的原代培养时间为（8.6±1.5）d，BM-MSCs的原代培养时间为（16.0±1.9）d，（P<0.05）；两种组织来源MSCs具有相似的形态，均呈梭形的成纤维细胞样细胞，AD-MSCs体外连续传代培养15代细胞无衰老征象，生长状态良好。AD-MSCs和BM-MSCs的体外培养生长曲线均呈“S”形，AD-MSCs在培养3~4d进入对数生长期，第7d进入平台期；BM-MSCs在培养4~5d进入对数生长期，第8d进入平台期。流式细胞仪检测结果表明：5代AD-MSCs的（G2%+S%）期细胞为（16.52±5.48）%，而BM-MSCs的（G2%+S%）期细胞比例为（7.26±2.34）%，差异有统计学意义。AD-MSCs和BM-MSCs均高表达MSCs的特征性表面标记CD44、CD29和CD105，不表达造血干细胞的表面标志CD34。乙型肝炎肝硬化患者AD-MSCs和BM-MSCs体外分化潜能无差异，体外均可以诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和神经细胞。2.三步法体外成功诱导乙型肝炎肝硬化患者AD-MSCs分化为功能性的肝细胞，成肝细胞诱导培养后AD-MSCs细胞形态逐渐由梭形成纤维细胞样细胞分化成多角形，类肝细胞形态的细胞；诱导培养11和18d免疫组织化学染色结果显示：AD-MSCs表达肝细胞特异性标志物AFP、ALB和CK-18，AFP阳性细胞百分率分别为（45.6±6.3）%和（17.6±1.5）%，ALB阳性细胞百分率分别为（45.8±5.2）%和（78.9±8.6）%，CK-18阳性细胞百分率分别为（30.5±4.8）%和（70.4±9.3）%，与未诱导组比较差异有统计学意义（P<0.05）；Western blotting结果与免疫组织化学染色结果一致；诱导分化细胞具有成熟肝细胞特有糖原合成功能，诱导培养11和18d，PAS染色阳性细胞百分率分别为（41.2±8.5）%和（86.9±11.3）%，与未诱导组比较差异有统计学意义（P <0.05）；诱导分化细胞体外合成和分泌白蛋白，诱导培养11和18d培养液上清白蛋白浓度分别为（0.18±0.089）ug/ml和（0.23±0.098）ug/ml，与未诱导组比较差异有统计学意义（P <0.05）。3.高滴度HBV感染血清培养后AD-MSCs的细胞形态、细胞生长曲线、生长速度及体外成脂肪细胞和成骨细胞分化潜能无改变；免疫组织化学染色和Western blotting技术检测原代培养的乙型肝炎肝硬化患者AD-MSCs、传代培养的3代、5代以及成肝诱导培养18d的AD-MSCs未感染HBV；高滴度HBV环境对AD-MSCs体外成肝细胞分化无影响，细胞形态变化与正常诱导方案诱导过程中细胞形态变化一致；诱导培养11和18dAFP表达阳性率分别为（42.4±7.8）%和（15.3±2.8）%，ALB表达阳性率分别为（39.4±6.8）%和（70.2±7.3），CK-18阳性率分别为（31.3±5.8）%和（63.2±8.3）%，与未诱导组比较差异有统计学意义（P<0.05）；细胞具有糖原合成功能，诱导11和18dPAS染色阳性细胞百分率分别为（37.4±7.6）%和（80.2±12.4）%，与未诱导组比较差异有统计学意义（P<0.05）。综上研究表明，Ⅰ型胶原酶消化结合AD-MSCs贴壁生长的特性可以从皮下脂肪组织分离获得大量、高活性和高纯度的AD-MSCs；乙型肝炎肝硬化患者AD-MSCs在体外分离培养成功率和增殖速度等方面明显优于BM-MSCs，AD-MSCs体外易于分离培养，增殖迅速，在短期内即可获得大量的细胞；采用在培养过程中添加细胞因子和诱导剂的三步诱导法体外诱导乙型肝炎肝硬化患者AD-MSCs分化为有功能的肝细胞，表达肝细胞系特异性蛋白AFP、ALB和CK-18，具有成熟肝细胞特有的糖原和白蛋白合成功能；乙型肝炎肝硬化患者AD-MSCs未感染HBV，传代培养AD-MSCs和成肝细胞诱导分化AD-MSCs体外不感染HBV；在高滴度HBV环境中，AD-MSCs可以诱导分化为肝细胞，维持成熟肝细胞的具体功能，同时抵抗乙肝病毒感染。本研究的创新点是在建立乙型肝炎肝硬化患者AD-MSCs体外培养体系的基础上，系统评价了其生物学特性，探讨其向肝细胞分化的潜能，同时观察AD-MSCs的HBV易感性及高滴度HBV环境对AD-MSCs成肝细胞分化的影响，为更加容易且安全的获取AD-MSCs，为临床乙型肝炎肝硬化患者应用自体AD-MSCs移植提供实验基础和理论依据。