目的:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,世界范围内,肺癌的发病率和死亡率高居肿瘤首位。肺癌进展迅速,病死率高,也是严重危害我国国民身体健康的一个重大公共卫生问题。寻找合理有效的生物标志,做到有效预防、早期诊断及合理治疗对提高患者生存率和生存质量有着重要的意义。人群流行病学及肿瘤病因学研究认为肺癌的发生是环境和遗传因素共同作用的结果。“体细胞突变学说”目前仍然是一种公认的致癌机制学说。环境致癌因子多环芳烃的代表物质B[a]P广泛存在于香烟烟雾、发动机废气、石油等燃烧产生的烟气中,甚至农业土壤中。B[a]P是一种间接致癌物,在进入人体后迅速分布在人体各种组织中在通过细胞色素P450酶代谢成终致癌物BPDE发挥致癌作用。BPDE具有亲核性可以与DNA形成BPDE-DNA加合物,会导致一些重要基因的突变:如癌基因的激活或抑癌基因的失活,成为肿瘤发生发展的起始动力。PPP1R13L是新近发现的一个重要的原癌基因,是高度保守的TP53凋亡刺激蛋白家族的第三个成员,可抑制另外两个成员(ASPP1和ASPP2)发挥抑癌作用,对野生型TP53活性进行特异性负调节并抑制细胞凋亡,促进细胞异常增殖。PPP1R13L还可以通过DLT序列与转录因子Nrf2竞争结合Keap1,导致Nrf2泛素化减少和Nrf2积累增加,核转位和抗氧化反式激活,iASPP-Keap1-Nrf2轴在体外和体内均促进肿瘤生长。但是,此外,PPP1R13L还抑制转录因子NF-κB家族中的重要成员RelA,故被命名为RAI。NF-κB参与多种生理过程,包括细胞增殖、细胞凋亡和免疫应答。因其抗凋亡和促肿瘤的作用NF-κB信号通路也成为了肿瘤研究的热点,更是被当做肿瘤治疗的靶点。CD3EAP与PPP1R13L 5’端相互重叠。CD3EAP是RNA聚合酶I的亚单位,参与细胞增殖过程,参与T细胞受体相关的CD3?通路。CD3EAP 3’端与DNA修复基因ERCC1相互重叠,而ERCC1所编码的蛋白是核苷酸切除修复系统NER的重要限速酶,对于BPDE-DNA加合物起到关键的修复作用。在我们的前期工作中发现通过shRNA敲低CD3EAP后,ERCC1表达同样下调,提示CD3EAP可能通过影响ERCC1而参与DNA修复通路。而CD3EAP与PPP1R13L之间是否有相似的关联尚不明确。在我们前期研究中发现CD3EAP与PPP1R13L之间可能存在双向启动子,由此我们认为CD3EAP与PPP1R13L之间存在某种共表达模式。虽然有许多SNP相关研究把CD3EAP与PPP1R13L作为一个整体预测肿瘤的发病风险和预后,但是始终没有试验证据证明两个基因在功能上的相关关系。通过文献挖掘我们发现,有研究通过体外液相色谱串联质谱实验中发现CD3EAP蛋白可以与NF-κB抑制蛋白NFKBIB物理结合,但其作用方式及机制尚未被验证。由此我们假设NF-κB通路是PPP1R13L与CD3EAP两个基因在功能上的确切联结点之一。microRNA(miRNA)是一类高度保守的、内源性的长度在18-23nt的非编码RNA,通过特异结合mRNA的3’UTR区,特异性抑制靶基因mRNA翻译过程或促进mRNA的降解,在转录后水平调控基因的表达。哺乳动物体内超过30%的基因表达受到miRNA的调控,每种miRNA均可调控多种靶基因,每个靶基因也可以同时被多种miRNA调控,而且在人体内miRNA数量及其庞大,就构成了一个复杂的miRNA调控网络,在多种病理生理病理过程中发挥重要的作用,尤其是在肿瘤发生发展过程中。而miRNA对重叠基因之一的调控是否会影响到二者的共表达模式值得探讨。研究方法:1.在中国医科大学附属第一医院胸外科收集确诊的肺癌手术病例84例。填写包含吸烟、饮酒等基本信息的调查问卷。方案和知情同意书由中国医科大学伦理审查委员会批准。术中切除组织,立即送往病理检测后,存于液氮中用于后续实验。配对的癌旁组织取自距癌组织至少5cm处。所有病人均诊断明确,且未接受术前治疗。记录包括肿瘤类型、肿瘤大小、淋巴结转移情况、TNM分期(2017年最新TNM分期标准)等肿瘤生物学特征。分别提取病例组织RNA和蛋白,real-time PCR、western blot检测癌与癌旁组织中PPP1R13L和CD3EAP mRNA和蛋白水平。比较各基因在癌与癌旁组织中mRNA、蛋白的表达,分析两个基因的共表达模式。多环芳烃类环境致癌物的代表苯并[a]芘-7,8-二氢二醇-9,10-环氧化物BPDE诱导16HBE细胞建立恶性转化细胞模型,检测低剂量处理恶性转化过程中不同代数细胞不同时间后,PPP1R13L和CD3EAP mRNA表达水平,验证PPP1R13L和CD3EAP mRNA水平的相关性。2.在A549细胞中通过转染siRNA或过表达质粒的方法,分别敲低或过表达CD3EAP与PPP1R13L,检测CD3EAP与PPP1R13L mRNA和蛋白表达层面的相互作用。通过免疫共沉淀的验证CD3EAP与PPP1R13L蛋白间的相互作用。通过RelA激活实验在A549细胞中分别敲低CD3EAP与PPP1R13L后,检测RelA功能的改变,以验证NF-κB通路是否是PPP1R13L与CD3EAP两个基因在功能上的联结点。3.通过生物信息学的方法筛选调控CD3EAP与PPP1R13L的miRNA,并通过双荧光素酶报告基因法验证miRNA对靶基因CD3EAP与PPP1R13L的直接调控作用。Real-time PCR检测癌与癌旁组织以及恶性转化细胞中miRNA的表达水平,验证CD3EAP及PPP1R13L mRNA与miRNA表达的相关关系。A549细胞系中分别转染miRNA模拟物后,检测靶基因CD3EAP及PPP1R13L mRNA及蛋白的改变,以及细胞RelA功能的改变。结果:1.CD3EAP mRNA水平在肿瘤组织中表达低于其相应癌旁组织(P<0.05)。而PPP1R13L在肺癌与癌旁组织中没有显著差异。分层分析结果显示PPP1R13L mRNA水平与患者吸烟与否和分期相关,肺癌组织中PPP1R13L mRNA表达在非吸烟病例中表达高于吸烟病例,早期病例高于晚期病例。在肺癌与癌旁组织中,PPP1R13L与CD3EAP mRNA之间都存在共表达关系。癌与癌旁组织的PPP1R13L和CD3EAP蛋白表达并没有明显差别,但PPP1R13L和CD3EAP蛋白水平同样存在共表达关系。低剂量BPDE处理不同代数恶转细胞时,0代细胞时CD3EAP与PPP1R13L mRNA水平呈现相关关系,而20代和40代细胞中CD3EAP与PPP1R13L mRNA水平不再呈相关关系。2.在A549细胞中分别敲低PPP1R13L或CD3EAP后,CD3EAP或PPP1R13L mRNA水平也随之出现下调。反之,在A549细胞中过表达PPP1R13L或CD3EAP后,细胞中CD3EAP或PPP1R13L mRNA水平均显著提升。免疫共沉淀显示PPP1R13L和CD3EAP两种蛋白并不形成复合物。在A549细胞中敲低PPP1R13L或CD3EAP都会引起RelA核转位能力的上调。3.miR-182-5p可以直接下调PPP1R13L的表达,而miR-125a-3p可以直接下调CD3EAP的表达。miR-125a-3p模拟物可以同时降低CD3EAP和PPP1R13L表达,从而提高细胞RelA的核转位能力。结论:1.共同位于19q3.3的反向重叠基因CD3EAP和PPP1R13L mRNA和蛋白水平均存在共表达的分子模式。肺癌分子特征分析和细胞恶性转化试验提示在肺癌组织中CD3EAP和PPP1R13L mRNA水平的共表达容易被破坏。2.在体外转染实验中,CD3EAP和PPP1R13L mRNA及蛋白水平变化同高同低,可能是通过形成mRNA-mRNA复合物从而相互保护不被降解。但CD3EAP和PPP1R13L两种蛋白并不通过形成复合物从而发挥相互作用。3.NF-κB家族是CD3EAP和PPP1R13L两基因的共同作用通路,CD3EAP和PPP1R13L对RelA蛋白核转位能力均有抑制作用。4.miR-125a-3p模拟物可以通过直接降低CD3EAP mRNA水平,间接降低了PPP1R13L mRNA水平的表达,从而增强细胞RelA的功能。