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研究背景乳腺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率高居所有女性恶性肿瘤的首位。同样,我国女性乳腺癌发病率仍居女性恶性肿瘤的第一位,死亡率排第五位,且发病呈现上升及年轻化趋势。乳腺癌的死因90%系肿瘤远处转移所致,其中尤以肺转移预后较差。乳腺癌肺转移的机制尚未阐明,多项研究表明可能与上皮间质化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）、乳腺癌干细胞、肿瘤微环境、循环肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞、非编码RNA等有关。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类具有5’端的帽和3’端的尾的单链共价环状结构的非编码RNA。研究发现,circRNAs在乳腺癌中表达失调可能参与乳腺癌的发生、发展、细胞增殖与凋亡、转移及耐药等调控。乳腺癌的转移具有明显的器官选择特性,有研究者采用RNA测序,筛选与鉴定出乳腺癌脑转移相关的circRNAs,但原发癌与肺转移癌circRNAs差异表达的确切机制仍待研究。目的与意义本课题选取原发乳腺癌及肺转移癌组织,筛选出差异表达circRNAs,挑选表达水平差异最大的circRNAs,进行功能及机制分析,探讨circFBXL5表达水平及在乳腺癌肺转移中的作用和分子机制。本研究结果将为乳腺癌肺转移,提供可能的预测标志物及治疗靶点,亦将为乳腺癌治疗开拓新思路。方法采用circRNA芯片筛选乳腺癌原发组织与肺转移组织中差异表达的circRNAs,并选择差异表达最显著的前20个circRNA进行验证;采用qRT-PCR检测circ FBXL5、miR-660及SRSF6 mRNA的表达;采用Kaplan-Meier生存分析circFBXL5表达与乳腺癌患者预后的关系;采用CCK8检测乳腺癌细胞活性;采用克隆形成实验检测乳腺癌细胞克隆形成能力;构建乳腺癌裸鼠移植瘤模型,检测沉默circFBXL5的表达后乳腺癌细胞成瘤能力;构建乳腺癌肺转移裸鼠模型,检测下调circ FBXL5表达后乳腺癌细胞肺转移能力的变化;生物信息学分析预测能与circFBXL5结合的miRNA及miR-660的靶基因;采用荧光素酶活性分析检测circFBXL5与miR-660、miR-660与SRSF6、circFBXL5与SRSF6结合情况;采用RIP检测circ FBXL5、miR-660及SRSF6与Ago2结合情况。结果一、乳腺癌原发组织与肺转移组织差异表达的circRNAs与乳腺癌原发组织相比,在肺转移组织中表达增加倍数最高的前20个circRNA包括hsacirc0125597、hsacirc3336-9和hsa-circ3617-3等;表达降低倍数最高的前20个circRNA包括hsa-circ5044-5、hsacirc0002018和hsacirc0010438等,其中hsacirc0125597在肺转移组织中表达增加最多。二、circFBXL5在乳腺癌细胞中高表达且与预后呈负相关circFBXL5主要在MDA-MB-453和MDA-MB-231细胞胞浆中表达,细胞核表达低于细胞浆中的表达（P<0.05）。qRT-PCR检测结果显示,与正常乳腺上皮MCF10A比较,circFBXL5在多株乳腺癌细胞中表达上调,在MDA-MB-231细胞中表达最高,在MDA-MB-453细胞中表达次之,而在MCF7、BT474细胞中表达增加不明显（P<0.05）。生存曲线分析显示,circFBXL5表达低的乳腺癌患者总生存时间较长,而circFBXL5表达高的乳腺癌患者总生存时间较短（P<0.05）。三、circFBXL5在乳腺癌中发挥促瘤作用CCK8细胞活性检测结果显示,转染circFBXL5 siRNA后,MDA-MB-453与MDA-MB-231细胞活性较对照组比较显著降低。克隆形成实验结果显示,circFBXL5 siRNA组克隆数与对照组相比显著减少（P<0.05）。在裸鼠成瘤实验中,在MDA-MB-231及MDA-MB-453细胞裸鼠移植瘤模型中,与注射对照序列组比较,注射circFBXL5siRNA组瘤体重量更小（P<0.05）。在裸鼠肺转移瘤模型实验中,与对照序列组比较,circFBXL5 siRNA组肺组织中转移灶数量减少（P<0.05）。四、circFBXL5在乳腺癌中通过与miR-660竞争性结合SRSF6CircInteractome在线网站预测到circFBXL5可能与miR-660结合。qRT-PCR结果显示,与MCF10A相比,miR-660在多株乳腺癌细胞中均表达下调,在MDA-MB-231细胞中表达最低（P<0.05）。Luciferase reporter assay证实circFBXL5可与miR-660直接结合。在线软件Targetscan预测SRSF6为miR-660的靶基因。qRT-PCR结果显示,与MCF10A相比,SRSF6在多株乳腺癌细胞中表达上调,在MDA-MB-231细胞中表达最高,且miR-660可抑制SRSF6在乳腺癌细胞中的表达（P<0.05）。RIP检测了乳腺癌MDA-MB-453和MDA-MB-231细胞中circFBXL5、miR-660及SRSF6分别与Ago2的结合情况,结果显示不论在MDA-MB-453细胞还是MDA-MB-231细胞中,Ago2组circFBXL5、miR-660和SRSF6富集的量均显著高于IgG组（P<0.05）。RIP检测发现在乳腺癌MDA-MB-453和MDA-MB-231细胞中,抑制circFBXL5的表达可增加Ago2蛋白上SRSF6富集（P<0.05）。qRT-PCR证实当抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-453中circFBXL5的表达时,SRSF6表达降低,同时抑制miR-660的表达可恢复SRSF6的表达水平（P<0.05）。结论1、circFBXL5在乳腺癌组织中高表达,其表达与乳腺癌肺转移患者预后呈负相关,可作为预后判断的潜在标志物;2、抑制乳腺癌细胞中circFBXL5的表达可抑制细胞增殖、克隆形成、体内成瘤和肺转移的发生;3、乳腺癌细胞中SRSF6是miR-660的直接靶基因;4、乳腺癌细胞中,circFBXL5可能作为miR-660的ceRNA,竞争性结合SRSF6发挥促癌作用。