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猪的胃肠道中存在着大量、多种的微生物,它们形成一个复杂的微生态系统调控着蛋白质在猪整个肠道中的代谢,影响着动物的健康和生产性能。传统的营养学观点认为小肠仅仅是营养物质消化和吸收的部位,然而近年来随着肠道微生物研究的发展,学者发现猪小肠微生物能够代谢利用大多数氨基酸,即微生物对氨基酸的“首过性”代谢。因此探究猪小肠微生物对蛋白质的代谢有助于寻求新的策略改善日粮蛋白质和氨基酸在动物营养功能方面的作用,从而提高氮的利用效率,降低氮污染。近年来许多研究表明,反刍动物瘤胃中许多细菌在氨基酸和小肽形式的氮源存在时,能够优先代谢利用小肽,甚至一些细菌不能以游离氨基酸作为其氮源。目前关于猪小肠微生物对游离氨基酸和小肽形式氮源的利用差异研究较少。本论文主要以酶水解酪蛋白(水解产物以小肽为主)和酸水解酪蛋白(水解产物以游离氨基酸为主)作为小肽和游离氨基酸模型,研究了小肽和游离氨基酸对猪小肠氮代谢和微生物菌群的影响,探究猪小肠微生物对小肽和游离氨基酸的代谢特点及差异,以期为提高蛋白质营养利用率和控制氮排泄提供依据,为改进猪的蛋白质营养策略提供参考。本论文分为四部分:1.体外法探究猪小肠微生物对两种酪蛋白水解物分解代谢的影响本章旨在探究猪小肠不同部位(十二指肠、空肠和回肠)和区位(肠腔和肠壁)微生物对两种不同氮形式酪蛋白水解物的分解代谢特性。以来自5头杜×长×大肥育猪的十二指肠、空肠、回肠肠腔食糜或者肠壁微生物接种物,分别以酸水解酪素(水解产物以游离氨基酸为主)和酶水解酪蛋白(水解产物以小肽为主)为底物进行发酵。每组4个重复,37℃C厌氧培养12小时,于0、3、6、12小时采样测定发酵液中游离氨基酸,肽氨基酸和菌体氨基酸。结果显示,比较微生物对两种不同酪蛋白水解物总游离氨基酸和总肽氨基酸的利用发现,微生物以酶水解酪蛋白为底物时,在发酵采样点都呈现出总肽氨基酸的利用量显著高于总游离氨基酸的利用量(P<0.05)。而在以酸水解酪蛋白为底物时,十二指肠肠腔、肠壁微生物以及回肠肠腔微生物在发酵3小时后,总肽氨基酸的利用量显著高于总游离氨基酸的利用量(P<0.05),随着发酵时间的推移这种差异不再显著,到发酵终点时,总肽氨基酸的利用显著低于总游离氨基酸的利用(P<0.05)。比较微生物利用两种不同酪蛋白水解物对菌体蛋白的合成发现,十二指肠肠腔、回肠肠腔、回肠肠壁微生物在发酵6小时和12小时后,酶水解酪蛋白组总菌体氨基酸的合成量显著高于酸水解酪素组(P<0.05),十二指肠肠壁微生物在发酵12小时后总菌体氨基酸的合成量显著高于酸水解酪素组(P<0.05)。以上结果提示:尽管小肠微生物对于不同形式的氮源有一定的适应性,但是小肠微生物更倾向于利用小肽来合成菌体蛋白。2.体外法探究两种酪蛋白水解物对猪小肠微生物发酵特性和菌群组成的影响本章通过体外法探究了不同氮形式的酪蛋白水解物对猪小肠微生物发酵和生长的影响。试验材料和设计同第一章。于0、3、6、12小时采样,测定氨态氮、微生物蛋白、短链脂肪酸以及用实时定量PCR进行菌群分析。结果发现1)肠腔微生物发酵不同酪蛋白水解物:十二指肠和回肠酶水解酪蛋白组MCP、总SCFAs的浓度显著高于酸水解酪蛋白组(P<0.05)。十二指肠酶水解酪蛋白组Total bacteria、Firmicutes的数量显著高于酸水解酪蛋白组(P<0.05)。回肠发酵6小时后,酶水解酪蛋白组Eschherichhia coli和Firmicutes的数量显著高于酸水解酪蛋白组(P<0.05);发酵12小时后,酶水解酪蛋白组Total bacteria、Lactobacillus、Ecoli的数量均显著高于酸水解酪蛋白组。2)肠壁微生物发酵不同酪蛋白水解物:发酵12小时后,酶水解酪蛋白组十二指肠和回肠MCP、总SCFAs含量显著高于酸水解酪蛋白组(P<0.05)。十二指肠酶水解酪蛋白组Lactobacillus、Firmicutes的数量分别极显著、显著高于酸水解酪蛋白组;回肠Firmicutes的数量在酶水解酪蛋白组组显著高于酸水解酪蛋白组(P<0.05)。以上结果提示:相比于游离氨基酸,小肽更能促进小肠微生物的发酵,且更有利于Firmicutes的生长。3.两种酪蛋白水解物对猪回肠微生物菌群组成的影响本章在上述研究基础上,通过高通量测序技术,探究在以酶水解酪蛋白(水解产物以小肽为主)或者以酸水解酪蛋白(以游离氨基酸为主)为底物时,回肠肠腔和肠壁微生物体外发酵12小时后微生物菌群组成的动态变化。本章对采集的回肠肠腔和肠壁微生物的0、3、6和12小时的发酵液样品,提取微生物DNA,采用16S rRNA高通量测序技术,对回肠肠腔和肠壁微生物发酵液中菌群结构进行分析。结果显示,在发酵终点时,发酵液中菌群多样性显著降低(P<0.05)。发酵12小时后,在门水平上酶水解酪蛋白组Firmicutes的丰度显著高于酸水解酪蛋白组(P<0.05),而Proteobacteria的丰度显著低于酸水解酪素组(P<0.05);在属水平上,酸水解酪素组回肠肠腔Eschherichia-SShgella的丰度显著高于酶水解酪蛋白组(P<0.05),而酶水解酪蛋白组Lactobacillus、Terrisporobacter和Turicibacter的丰度显著高于酸水解酪素组(P<0.05)。以上结果提示:不同氮形式的酪蛋白水解物会影响猪回肠微生物区系组成。相较于游离氨基酸,在门水平上,小肽能提高Firmicutes丰度和降低Proteobacteria丰度;在属水平上,小肽能提高Lactobacillus、Fusobacteria数量,并降低Escherichia-Shigella 的数 量。4.日粮不同氮形式对猪回肠肠腔微生物组成及发酵特性的影响日粮蛋白是动物氨基酸的主要来源,然而在现代化养殖生产中日粮中蛋白水平过高以及氨基酸添加的不平衡等问题不仅造成了蛋白质资源的浪费,且造成了环境中严重的“氮污染”。本试验在前期试验的基础上,分别用蛋白水平为16%粗蛋白(C组)、13%粗蛋白+游离氨基酸(A组)、13%粗蛋白+酶水解酪蛋白(P组)的日粮饲喂装有回肠瘘管的45日龄杜×长×大仔猪40天。试验结束当天,在饲喂0、3、6、12小时后通过瘘管收集回肠食糜,检测其微生物发酵特性和区系的变化。结果显示,进食3小时后P组的NH3-N浓度显著高于A组(P<0.05),P组的MCP、总SCFAs以及乙酸的浓度显著高于A组和C组(P<0.05)。各组回肠食糜微生物多样性无显著差异(P>0.05)。在门水平上,P组、A组和C组回肠菌群均以Firmicutes和Proteobacteria为主,但是其各自的比例因日粮氮形式和进食时间不同而不同,其中C组Firmicutes的丰度高于P组和A组,而P组的Proteobatceria丰度高于A组和C组。在属水平上,Lactobacillus、Enterococcus 和 Escherichia-Shigella 均是优势菌群。日粮氮 形式显著影响回肠食 糜 Lactobacillus,Enterococcus,Escherichia-Shigella,Holdemanella,Erysipelatoclostridium,Lachnospiraceae Unclassified 和 Collinsella 的丰度(P<0.05)。以上结果提示:低蛋白日粮中添加小肽能促进回肠肠腔微生物发酵,加快菌体蛋白质合成,同时提高Proteobacteria的丰度。上述结果表明,猪小肠微生物对两种不同氮形式的酪蛋白水解物的利用存在差异。小肠微生物更倾向于利用小肽合成菌体蛋白,且相较于小肽更能促进小肠微生物的发酵,且更有利于Firmicutes的生长。体内试验表明,低蛋白日粮下添加小肽低蛋白日粮下添加小肽能促进回肠肠腔微生物发酵,加快菌体蛋白质合成,同时提高Proteobacteria 的丰度。