小鼠心脏发育过程中钙离子通道的表达

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钙离子通过电压门控的钙离子通道进入心肌细胞,作为一种重要的第二信使,钙离子对于心脏的兴奋-收缩偶联以及心脏相关基因的表达调节都有十分重要的作用。心脏是小鼠胚胎第一个形成的器官,早期胚胎发育过程中,心肌细胞的肌浆网发育并不完善,故细胞膜上的钙离子通道对于维持心脏正常节律性搏动必不可少。但究竟是哪条途径在心肌细胞尚未发育成熟的情况下控制钙离子向胞内的流动并引发心肌细胞收缩跳动至今尚存在争论。最近有研究指出,在体外胚胎培养基中加入钙离子通道阻断剂尼非地平(Nifedipine)和维拉帕米(Verapamil),可导致胚胎小鼠心脏发育产生异常,提示钙离子通道在心脏发育的过程中发挥了重要作用。但通过简单的药物阻断作用进行表型分析,并不能完全真实反映钙离子通道在小鼠胚胎心脏发育中的表达模式及其作用机制。本研究旨在利用免疫组织化学,实时荧光定量PCR,免疫印迹等技术从蛋白、分子等不同水平来探讨小鼠心脏发育不同阶段钙离子通道的时空表达模式,为理解钙离子通道与心脏发育的关系提供参考数据。实验结果如下:   L 型钙离子通道的两种主要亚基α1C和α1D在mRNA 水平上都伴随着心脏节律性收缩的出现(E9.5)而出现,但两者的变化趋势有所不同,α1C在E14.5天出现了一次瞬时性的增高,随后又回落到原先的水平。而α1D在胚胎期的表达出现了两次较大的一过性上升,一次出现在E10.5,一次在E15.5,随即回落到较低的水平。在蛋白表达区域上,二者却十分相似,心肌发育的整个过程中,L 型钙离子通道始终在心肌细胞的胞质和胞膜中清晰可见,但是在早期流出道,房室管,以及由此衍生而来的房室瓣膜、血管流出道瓣膜、尚未成熟的心室肌小梁、室间隔以及小部分血管内皮中的内皮细胞和间充质细胞都未检测到该类蛋白的表达。   T 型钙离子通道的两种亚基在mRNA 水平的出现时间同L 型钙离子通道是一致的(E9.5),但两种亚基的表达趋势相反,α1G 随着小鼠的生长发育其表达量也随之升高,并在成年期稳定在一个较高的水平;而α1H 除了在E12.5的表达出现了一个小的回落之外,其余时间均维持在较高的水平,但出生后的α1HmRNA的表达量却远远低于胚胎期。免疫组化结果说明两者在小鼠胚胎心脏发育过程中的表达模式大致相似,主要分布在腔室壁、腔室间隔、以及肌小梁的心肌层,并且自始至终都稳定表达;而在慢速传导区域的流出道和房室交界的组织(房室瓣,主动脉瓣,肺动脉瓣)中都没能检测到T 型钙离子通道蛋白的阳性信号,这提示T 型钙离子通道对于心肌细胞的发育以及心脏快速传导区域的形成有着很重要的作用。   此外,对出生后小鼠心脏的免疫学以及PCR 试验都表明,四种钙离子通道亚基在心房的表达都要高于心室。   综上所述,分布在心脏中的四种钙离子通道虽然在mRNA 水平的表达各有不同,并且其表达时间亦有差异,但是其在心脏的分布区域却有共同之处:在心肌细胞的区域高表达,而在非心肌细胞区域表达缺失。这对于进一步研究钙离子通道与心肌发育的相互关系提供了一定的实验依据。
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