心房颤动(AF)是指心房快速的无规则的激动和收缩，它是临床上最常见的一类心律失常。随着年龄的增长房颤的发生呈逐年上升趋势，在65岁以上的人群中6％的人患有此类疾病。房颤可引起血栓栓塞、心动过速造成的心肌病、心力衰竭以及心室功能异常等严重并发症。它给医疗护理体系带来了相当大的经济负担。房颤的离子特性在决定心律失常的发生和特点方面扮演了重要的角色。持续性房颤同心房的电重构有关。L型钙电流的降低和内向整流性钾电流及乙酰胆碱敏感性钾电流的升高是房颤发生与持续的重要因素。房颤的发生也呈家族聚集倾向，这就提示我们某些个体的心律失常同遗传因素有关。一些家族性房颤的致病基因被定位在了染色体10q22和6q14-16，新的基因定位也在不断的被发现。2003年在一个具有早发房颤特征的家系中，发现钾离子通道KCNQ1基因的突变与房颤有关；随后的研究又发现了两个与房颤发生有关的基因，分别为KCNE2和KCNJ2。本实验室最近获得了一个具有家族性遗传特征的房颤家系，本课题拟寻找该家族房颤的致病基因，并对其致病的分子机制进行探讨。 第一部分：建立PCR-SSCP方法目的：建立聚合酶链-单链构象多态性分析方法，为筛查突变基因做准备。 方法：(1)预实验样本的选择：野生型Kir2.3质粒和突变型Kir2.3(I2123L)质粒。(2)凝胶浓度：PCR结果的鉴定采用2％的琼脂糖凝胶，SSCP分析采用12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶。(3)显色方法：琼脂糖凝胶EB显色，非变性聚丙烯酰胺凝胶DNA银染显色。(4)PCR产物变性比较了三种方法：即碱变性、SDS变性、加入甲酰胺变性上样液直接变性。(5)实验分组：根据凝胶中丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的比例分为A(49∶1)、B(29∶1)两组，每组再根据甘油的比例(0％、1％、5％)分三个小组，即A1、A2、A3和B1、B2、B3。(6)电泳条件：每块凝胶选择两种电泳条件电泳，分别为30mA恒流快速电泳和100V恒流过夜电泳。 小结：由于SSCP分析的高度敏感性和一些不明白的原因，其结果在分析时有一些难度。在本试验中只将它做为一种粗筛的手段，最后的结论以测序结果为准。 第二部分：筛查家族性房颤致病基因目的：寻找该家族性房颤的致病基因，并对其致病的分子机制进行探讨。 方法：(1)收集家系资料；(2)对家系成员进行临床诊断；(3)采集血样提取基因组DNA；(4)构建家系系谱；(5)设计特异性引物，PCR扩增目的片段；(6)采用SSCP方法对扩增产物进行粗筛；(7)若发现可疑基因则纯化PCR产物进行测序；(8)将测序结果经NCBI(美国国家生物技术信息中心)GenebankBLAST软件进行对比以发现可疑突变点；(9)将该点与SNP数据库中收录的多态性位点进行比对，以期获得通道突变信息。 小结：利用分子生物学，并结合遗传学、生物信息学的方法我们在KCNQ1基因上发现了一个新的与我们掌握的家族性房颤有关的单点突变，即KCNQ1(P448R)。进一步的通道功能研究将确证该突变是否为导致房颤发生的分子基础。 结论: 1.SSCP是一种简单快速的筛查基因突变的方法，但在不知道基因突变的类型和样本例数不太大的情况下，并不是最适合的方法。 2.在该房颤家系中发现了一个新的基因突变，即钾离子通道KCNQ1(P448R)点突变，此点突变是筛查的五个钾离子通道基因中唯一的一个突变，经初步分析认为KCNQ1(P448R)可能与家族性房颤有关，进一步的确证需要研究突变对通道功能的影响。