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论文Ⅰ巨噬细胞ILF3在动脉粥样硬化病变中的作用及临床应用价值研究
1.研究背景
据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)2018年统计数据显示，全球范围内每年约有1790万人死于心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)，占全球年总死亡率的31％。动脉粥样硬化是CVD的主要病因，最初仅仅被认为是血管退行性病变，但现在更多地被视作是一种慢性的脂质驱动的炎症浸润性疾病。胆固醇脂蛋白在动脉血管壁的浸润和积累是动脉粥样硬化的一个重要起始事件。这些脂蛋白的后续修饰诱导单核细胞浸润血管壁并分化为炎性细胞，炎性细胞分泌的炎性因子促进病变局部的炎症反应。根据2017年最新的CANTOS临床试验(Canakinumab抗血栓形成结果研究)数据显示，既往心肌梗死和高血清c反应蛋白的受试者接受IL-1β单克隆抗体(Canakinumab)或安慰剂治疗后，Canakinumab治疗组心血管事件的发生风险显著降低。此外，2019年最新的COLCOT试验结果数据也显示，与安慰剂组相比，0.5mg秋水仙碱治疗组可显著降低近期心肌梗死患者首次和总缺血性心血管事件发生的风险。Canakinumab与秋水仙碱作为直接的抗炎药物，这两项国际多中心、随机、双盲的临床试验均证明了动脉粥样硬化的发生与炎症密切相关。
免疫细胞的炎症反应是动脉粥样硬化形成和发展的重要因素。动脉粥样硬化斑块内的免疫细胞包括单核/巨噬细胞、树突状细胞、T细胞及B细胞等，其中对动脉粥样硬化发生、发展最重要的是巨噬细胞。在病变区域内，巨噬细胞摄取氧化的低密度脂蛋白颗粒(Oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)形成泡沫细胞参与动脉粥样硬化的形成。浸润到病变损伤区域的巨噬细胞迁移能力降低，它们分泌促炎细胞因子和趋化因子，同时通过调节胶原蛋白和蛋白酶如基质金属蛋白酶的产生影响斑块的稳定性，并最终诱导病变区域发展为复杂的动脉粥样硬化斑块。
白细胞介素增强结合因子3(Interleukin enhancer binding factor 3，ILF3)，也被称为NF90/NF110，编码的双链RNA结合蛋白可与其他蛋白、mRNA和非编码RNA结合，以管理基因表达和mRNA稳定。ILF3参与多种细胞学功能，现有文献对ILF3的报道主要集中在病毒领域。基因组和表观基因组关联研究发现ILF3可能在早期血脂异常、血栓形成、和中风亚型中发挥作用。据报道，非诺贝特作为一种降脂药物，可通过抑制ILF3活性来减轻炎症。此外还有研究发现在乳腺癌中，ILF3可通过调节血管内皮生长因子mRNA的稳定性促进血管生成。尽管有证据表明ILF3在血管疾病中起作用，但ILF3对动脉粥样硬化的影响尚未被证实。
课题组前期研究发现急性冠脉综合征(Acute coronary syndrome，ACS)患者的血清中ILF3水平升高明显，为了进一步明确ILF3在动脉粥样硬化中的关系，我们通过本实验探索ILF3对于动脉粥样硬化的具体影响以及其背后存在的机制。
2.目的
(1)明确巨噬细胞ILF3对动脉粥样硬化进展的影响;
(2)探究血清ILF3与动脉粥样硬化病变进展的关系;
(3)探究巨噬细胞ILF3与血清ILF3的关系。
3.方法
3.1临床动脉粥样硬化患者标本
依据齐鲁医院伦理委员会的伦理学要求，于山东省红十字会收集健康人体冠状动脉、颈动脉标本以及动脉粥样硬化疾病累及冠状动脉标本。
3.2实验动物
(1)动物品系:
1)动脉粥样硬化模型小鼠采用ApoE基因敲除8周龄雄性小鼠，C57/BL6J品系背景，购自北京华阜康公司，源自JacksonLab。
2)巨噬细胞特异性ILF3敲除小鼠(ILF3flox/flox)，C57/BL6J品系背景，由北京唯尚立德公司协助构建。
3)巨噬细胞特异性ILF3过表达小鼠(ILF3rosa-/+)，C57/BL6J品系背景，由北京唯尚立德公司协助构建。
4)Lyz2-Cre工具鼠由北京唯尚立德公司提供。
(2)构建巨噬细胞ILF3特异性表达小鼠
1)将ILF3flox/flox与Lyz2-Cre工具鼠交配得到巨噬细胞ILF3特异性敲除小鼠(ILF3flox/floxLyz2-Cre)，并命名为ILF3M-KO。
2)将ILF3rosa/+与Lyz2-Cre工具鼠交配得到巨噬细胞ILF3特异性高表达小鼠(ILF3rosa/+Lyz2-Cre)小鼠，并命名为ILF3M-TG。
上述所有小鼠繁殖过程中均用小鼠尾巴提取的DNA予以基因型鉴定。
3.3动脉粥样硬化模型建立
将上述巨噬细胞ILF3特异性敲除与过表达小鼠与ApoE-/-小鼠交配，获得ILF3WT/ApoE-/-，ILF3M-KO/ApoE-/-及ILF3M-Tg/ApoE-/-模型小鼠。经高脂饲料喂养8周、16周后，取材并将小鼠主动脉根部制作成切片，观察不同小鼠动脉粥样硬化斑块形成情况。
3.4标本组织免疫学染色
对人体冠状动脉、颈动脉标本及小鼠主动脉根部组织，切片分别行油红O染色观察斑块面积，天狼猩红染色检测胶原成分，CD68和α-SMA免疫学组织染色分析斑块内巨噬细胞及平滑肌细胞数量。依据上述染色数据计算斑块易损指数，易损指数=(巨噬细胞阳性面积％+脂质阳性面积％)/(平滑肌细胞阳性面积％+胶原阳性面积％)。
3.5腹腔巨噬细胞提取
对不同基因型小鼠腹腔注射6％淀粉，三天后利用细胞贴壁方法提取小鼠腹腔巨噬细胞用于后续细胞学实验。
4.结果
4.1ILF3表达含量与动脉粥样硬化程度呈正相关
(1)对人体标本中狭窄程度不同的冠状动脉进行ILF3组织化学染色检测，发现ILF3表达水平与冠状动脉狭窄程度呈现明显正相关性。
(2)Apoe-/-小鼠高脂喂养不同时间段，以构建动脉粥样硬化不同程度小鼠模型。取小鼠主动脉根部，通过组织化学染色和免疫印迹(Western blot)检测ILF3蛋白表达水平，发现随着Apoe-/-小鼠高脂喂养时间增加及动脉粥样硬化斑块的加重，血管ILF3蛋白的表达水平显著升高。
上述两项结果均表明在人体和小鼠动脉粥样硬化模型中，ILF3蛋白表达水平随着动脉粥样硬化程度的加重呈现显著的升高，提示ILF3的表达变化参与动脉粥样硬化的发生和发展。
4.2ILF3在动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞中显著高表达
通过免疫荧光检测发现:ILF3与巨噬细胞存在着明显的共定位现象;体外实验也证明ox-LDL刺激后，巨噬细胞ILF3蛋白的表达水平显著升高。
4.3巨噬细胞ILF3激活促进动脉粥样硬化斑块的形成并加剧斑块不稳定性
对小鼠主动脉根部染色并分析后发现:巨噬细胞ILF3的高表达可促进动脉粥样硬化斑块的形成，并使斑块的易损性增加;而抑制巨噬细胞ILF3的激活，可显著逆转这一现象。
4.4转录组测序和蛋白质组测序联合分析提示巨噬细胞ILF3活化与脂代谢及免疫炎症反应密切相关
通过对巨噬细胞进行转录组测序和蛋白质组测序分析，明确了ILF3活化与脂肪消化吸收及炎症反应等代谢途径相关，且与PI3K/AKT，MAPK和Rap1等信号通路密切相关。
4.5巨噬细胞ILF3活化促进斑块内脂质所致炎症微环境
巨噬细胞ILF3敲除可显著抑制泡沫细胞的形成，而巨噬细胞ILF3的过度表达则可促进泡沫细胞形成;小鼠主动脉根染色证实了巨噬细胞ILF3高表达可增加斑块内炎症因子表达，而巨噬细胞ILF3的敲降则可抑制炎症的产生。
5.结论
(1)ILF3在动脉粥样硬化斑块巨噬细胞中高表达，参与动脉粥样硬化斑块的形成与发展。
(2)抑制巨噬细胞ILF3活化可显著减缓动脉粥样硬化斑块的形成，并增加动脉粥样硬化斑块的稳定性;而巨噬细胞ILF3高表达则可促进动脉粥样硬化的发生和发展。
(3)巨噬细胞ILF3通过介导脂质驱动的炎症反应促进动脉粥样硬化斑块的发生与发展。
论文Ⅱ巨噬细胞ILF3影响脂质介导炎症微环境的分子机制研究
1.研究背景
动脉粥样硬化是一种由内皮损伤、脂质沉积和氧化应激引起的炎症性疾病，其特点是动脉壁内泡沫细胞聚集。泡沫细胞的形成是由于巨噬细胞脂质摄取过多和胆固醇代谢功能异常所致。除了过度的泡沫细胞堆积，巨噬细胞介导的炎症反应是动脉粥样硬化病变的另一个主要因素。在动脉粥样硬化的发生和发展中，巨噬细胞具有独特的双重功能——调节脂质积累和代谢，并维持慢性炎症反应，这两种途径与急性冠脉综合征的发病机制密切相关。血管巨噬细胞是高度不均匀的可塑细胞，在动脉粥样硬化形成的所有阶段，从坏死核心形成到斑块破裂，都发挥着重要作用。近年来，巨噬细胞极化被证明在炎症反应的调节中起着至关重要的作用。一般说来，巨噬细胞主要分化为两种表型:一是经典途径激活的促炎型巨噬细胞(M1型巨噬细胞)，另一种是非经典通路激活的抗炎型巨噬细胞(M2型巨噬细胞)。最近的研究数据表明在人类斑块中M2型巨噬细胞可导致斑块的消退。与此同时，小鼠的动脉粥样硬化实验模型也发现，在斑块消退过程中会出现M1型巨噬细胞减少和M2型巨噬细胞富集的现象，并且，有文章报道M2型巨噬细胞在抑制小鼠动脉粥样硬化进展中起着重要的正性作用。靶向抑制巨噬细胞M1型极化被认为是预防动脉粥样硬化发展的可行途径。
我们前面的研究已经证明巨噬细胞ILF3脂代谢异常的条件下，对动脉粥样硬化斑块的形成和稳定性有重要的调节作用，但具体机制仍未阐明。本研究利用巨噬细胞ILF3特异性敲除小鼠的巨噬细胞，通过转录组-蛋白质组学测序联合分析明确ILF3基因的调节靶点，并利用免疫沉淀-质谱检测分析与ILF3相互作用的蛋白，探究巨噬细胞ILF3对巨噬细胞极化以及炎症反应的相关细胞及分子机制，为临床寻找动脉粥样硬化可能的治疗靶点提供理论依据。
2.目的
(1)探讨巨噬细胞ILF3的调控靶点及对动脉粥样硬化斑块形成的相关机制;
(2)探讨巨噬细胞ILF3在脂代谢异常环境下的相互作用蛋白的变化及对动脉粥样硬化斑块形成的相关机制;
(3)揭示巨噬细胞ILF3介导斑块内巨噬细胞极化调控斑块炎症微环境的分子机制;
3.方法
3.1巨噬细胞分离培养
利用8～10周龄的ILF3M-WT、ILF3M-KO和ILF3M-Tg小鼠，在腹腔注射6％淀粉无菌混悬液后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)收集腹腔巨噬细胞，在添加10％牛血清、100U/mL链霉素和100U/mL青霉素的RPMI培养基中培养。
收集的腹腔巨噬细胞后续用于脂质吞噬实验、流式细胞术、RT-PCR或免疫沉淀质谱。
3.2RNA免疫沉淀反应(RIP)
按照MagnaRIPRNA-BindingProteinImmunoprecipitation试剂盒(Millipore，Billerica，MA，USA)要求进行RIP检测。用抗体包括抗ILF3抗体(Proteintech，Chicago，IL，USA)和IgG抗体L沉淀mRNA。最终用qRT-PCR进行分析，结果显示目标mRNA在免疫沉淀和Input组之间的倍数变化。
3.3mRNA稳定性分析和qRT-PCR
用放线菌素D(10 mg/mL)处理巨噬细胞0、2、4、8、12和24小时。样品悬浮在TRIzol试剂(Invitrogen #15596018)中。根据RNeasyMini试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)使用说明，从细胞中分离总RNA。使用带有gDNAerase(Perfect Real Time)的PrimeScriptRT试剂试剂盒(Takara，Japan)对总RNA进行逆转录，使用LightCycler480SYBRGreenⅠMaster(Roche Life Science，NSW，Australia)进行qRT-PCR。每个转录本的表达利用对照基因β-actin进行归一化处理以显示相对于对照样本的表达变化。
3.4免疫印迹(Western blot)
提取组织标本蛋白和细胞蛋白，经BCA法检测蛋白浓度后，通过SDS-PAGE电泳及相应抗体孵育检测蛋白表达含量。
3.5流式细胞术
腹腔巨噬细胞经50μg/mLoxLDL处理后，用M1和M2亚型的标志物对细胞进行标记，将标记的细胞清洗、收集并使用FACS流式细胞仪系统进行分析。
3.6免疫沉淀-质谱联合分析
如前所述，从C57BL/6小鼠腹腔中分离巨噬细胞。在1mL培养基中加入或不加入oxLDL(50μg/mL)孵育24小时。使用免疫沉淀试剂盒进行免疫沉淀。利用Western-blot收集胶块进行质谱分析。
3.7统计数据
使用GraphPadPrism8(GraphPad Software)和Rv3.5.0(R Foundation for Statistical Computing，Vienna，Austria)以及ggplot2软件包9，10进行统计分析。验证数据的正态分布后，对两组数据进行t检验，对三组或更多组进行单因素方差分析(Tukeys post test)评估统计差异。对于有两个自变量的数据，采用双因素方差分析和Bonferroni后测。所有检验均为双侧检验，p＜0.05为有统计学意义。
4.结果
4.1转录组和蛋白质组联合分析提示巨噬细胞ILF3基因的表达变化与脂代谢异常及炎症免疫反应密切相关
通过对巨噬细胞转录组学的测序和蛋白质组学测序的联合分析，我们明确了ILF3基因的表达变化与脂代谢及免疫炎症反应等相关途径密切关联，且与CD36、Arginase1(Arg1)、MMPs等相关基因的表达调控密切相关。
4.2巨噬细胞ILF3敲除通过调节脂代谢抑制泡沫细胞的形成
ILF3M-WTApoE-/-，ILF3M-KOApoE-/-和ILF3M-TgApoE-/-小鼠，高脂喂养16周后，血清学检测发现:与ILF3M-WTApoE-/-相比，ILF3敲除组(ILF3M-KO ApoE-/-)小鼠血清中胆固醇(Cholesterol，CHO)和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)水平显著下降，而ILF3过表达小鼠组(ILF3M-Tg ApoE-/-)血清中胆固醇(CHO)和低密度脂蛋白(LDL)水平显著升高。提取各组小鼠腹腔巨噬细胞进行油红O染色发现:与对照组相比，ILF3敲除后，巨噬细胞摄取ox-LDL的能力显著降低，而过表达ILF3的巨噬细胞对ox-LDL摄取显著增强。
4.3巨噬细胞ILF3介导巨噬细胞极化，调节巨噬细胞的炎症因子分泌
体外诱导巨噬细胞分化发现:巨噬细胞ILF3的激活促进巨噬细胞向M1型转化，ILF3基因敲除，可显著抑制LPS和ox-LDL诱导的巨噬细胞向M1型转化。同时巨噬细胞ILF3基因敲除显著降低白细胞介素6(Interleukin 6，IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TumorNecrosisFactor-α，TNF-α)等炎症因子的释放。ILF3过度表达则可促进LPS和ox-LDL诱导的巨噬细胞向M1型转分化及炎症因子的分泌。
4.4巨噬细胞ILF3通过ILF3-Rap1A/ERK/AP-1途径调节脂质介导的炎症反应
通过对腹腔巨噬细胞进行IP-MS分析，我们明确了在ox-LDL处理下，巨噬细胞内ILF3可与Rap1A特异性结合且存在正性反馈作用。此外，我们也首次证明了ILF3-Rap1A的正反馈可促进MAPK通路的激活并增强C-FOS和C-Jun(激活蛋白-1[AP-1]的两个亚基)的活性从而促进炎症反应。
4.5巨噬细胞ILF3通过调节Arg1mRNA的稳定性影响巨噬细胞极化
利用RNA免疫沉淀我们确认了ILF3和Arg1mRNA之间的相互作用。RIP-PCR分析证明了ox-LDL可促进ILF3与Arg1mRNA的结合;且ILF3与Arg1mRNA的结合可促进巨噬细胞Arg1mRNA的降解。
5.结论
(1)揭示了巨噬细胞ILF3缺失可抑制泡沫细胞形成;
(2)阐明了巨噬细胞ILF3可促进斑块内巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化;
(3)揭示了巨噬细胞ILF3通过ILF3-Rap1A/ERK/AP-1途径以及Arg1mRNA的稳定性影响巨噬细胞内的炎症反应。
1.研究背景
据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)2018年统计数据显示，全球范围内每年约有1790万人死于心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)，占全球年总死亡率的31％。动脉粥样硬化是CVD的主要病因，最初仅仅被认为是血管退行性病变，但现在更多地被视作是一种慢性的脂质驱动的炎症浸润性疾病。胆固醇脂蛋白在动脉血管壁的浸润和积累是动脉粥样硬化的一个重要起始事件。这些脂蛋白的后续修饰诱导单核细胞浸润血管壁并分化为炎性细胞，炎性细胞分泌的炎性因子促进病变局部的炎症反应。根据2017年最新的CANTOS临床试验(Canakinumab抗血栓形成结果研究)数据显示，既往心肌梗死和高血清c反应蛋白的受试者接受IL-1β单克隆抗体(Canakinumab)或安慰剂治疗后，Canakinumab治疗组心血管事件的发生风险显著降低。此外，2019年最新的COLCOT试验结果数据也显示，与安慰剂组相比，0.5mg秋水仙碱治疗组可显著降低近期心肌梗死患者首次和总缺血性心血管事件发生的风险。Canakinumab与秋水仙碱作为直接的抗炎药物，这两项国际多中心、随机、双盲的临床试验均证明了动脉粥样硬化的发生与炎症密切相关。
免疫细胞的炎症反应是动脉粥样硬化形成和发展的重要因素。动脉粥样硬化斑块内的免疫细胞包括单核/巨噬细胞、树突状细胞、T细胞及B细胞等，其中对动脉粥样硬化发生、发展最重要的是巨噬细胞。在病变区域内，巨噬细胞摄取氧化的低密度脂蛋白颗粒(Oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)形成泡沫细胞参与动脉粥样硬化的形成。浸润到病变损伤区域的巨噬细胞迁移能力降低，它们分泌促炎细胞因子和趋化因子，同时通过调节胶原蛋白和蛋白酶如基质金属蛋白酶的产生影响斑块的稳定性，并最终诱导病变区域发展为复杂的动脉粥样硬化斑块。
白细胞介素增强结合因子3(Interleukin enhancer binding factor 3，ILF3)，也被称为NF90/NF110，编码的双链RNA结合蛋白可与其他蛋白、mRNA和非编码RNA结合，以管理基因表达和mRNA稳定。ILF3参与多种细胞学功能，现有文献对ILF3的报道主要集中在病毒领域。基因组和表观基因组关联研究发现ILF3可能在早期血脂异常、血栓形成、和中风亚型中发挥作用。据报道，非诺贝特作为一种降脂药物，可通过抑制ILF3活性来减轻炎症。此外还有研究发现在乳腺癌中，ILF3可通过调节血管内皮生长因子mRNA的稳定性促进血管生成。尽管有证据表明ILF3在血管疾病中起作用，但ILF3对动脉粥样硬化的影响尚未被证实。
课题组前期研究发现急性冠脉综合征(Acute coronary syndrome，ACS)患者的血清中ILF3水平升高明显，为了进一步明确ILF3在动脉粥样硬化中的关系，我们通过本实验探索ILF3对于动脉粥样硬化的具体影响以及其背后存在的机制。
2.目的
(1)明确巨噬细胞ILF3对动脉粥样硬化进展的影响;
(2)探究血清ILF3与动脉粥样硬化病变进展的关系;
(3)探究巨噬细胞ILF3与血清ILF3的关系。
3.方法
3.1临床动脉粥样硬化患者标本
依据齐鲁医院伦理委员会的伦理学要求，于山东省红十字会收集健康人体冠状动脉、颈动脉标本以及动脉粥样硬化疾病累及冠状动脉标本。
3.2实验动物
(1)动物品系:
1)动脉粥样硬化模型小鼠采用ApoE基因敲除8周龄雄性小鼠，C57/BL6J品系背景，购自北京华阜康公司，源自JacksonLab。
2)巨噬细胞特异性ILF3敲除小鼠(ILF3flox/flox)，C57/BL6J品系背景，由北京唯尚立德公司协助构建。
3)巨噬细胞特异性ILF3过表达小鼠(ILF3rosa-/+)，C57/BL6J品系背景，由北京唯尚立德公司协助构建。
4)Lyz2-Cre工具鼠由北京唯尚立德公司提供。
(2)构建巨噬细胞ILF3特异性表达小鼠
1)将ILF3flox/flox与Lyz2-Cre工具鼠交配得到巨噬细胞ILF3特异性敲除小鼠(ILF3flox/floxLyz2-Cre)，并命名为ILF3M-KO。
2)将ILF3rosa/+与Lyz2-Cre工具鼠交配得到巨噬细胞ILF3特异性高表达小鼠(ILF3rosa/+Lyz2-Cre)小鼠，并命名为ILF3M-TG。
上述所有小鼠繁殖过程中均用小鼠尾巴提取的DNA予以基因型鉴定。
3.3动脉粥样硬化模型建立
将上述巨噬细胞ILF3特异性敲除与过表达小鼠与ApoE-/-小鼠交配，获得ILF3WT/ApoE-/-，ILF3M-KO/ApoE-/-及ILF3M-Tg/ApoE-/-模型小鼠。经高脂饲料喂养8周、16周后，取材并将小鼠主动脉根部制作成切片，观察不同小鼠动脉粥样硬化斑块形成情况。
3.4标本组织免疫学染色
对人体冠状动脉、颈动脉标本及小鼠主动脉根部组织，切片分别行油红O染色观察斑块面积，天狼猩红染色检测胶原成分，CD68和α-SMA免疫学组织染色分析斑块内巨噬细胞及平滑肌细胞数量。依据上述染色数据计算斑块易损指数，易损指数=(巨噬细胞阳性面积％+脂质阳性面积％)/(平滑肌细胞阳性面积％+胶原阳性面积％)。
3.5腹腔巨噬细胞提取
对不同基因型小鼠腹腔注射6％淀粉，三天后利用细胞贴壁方法提取小鼠腹腔巨噬细胞用于后续细胞学实验。
4.结果
4.1ILF3表达含量与动脉粥样硬化程度呈正相关
(1)对人体标本中狭窄程度不同的冠状动脉进行ILF3组织化学染色检测，发现ILF3表达水平与冠状动脉狭窄程度呈现明显正相关性。
(2)Apoe-/-小鼠高脂喂养不同时间段，以构建动脉粥样硬化不同程度小鼠模型。取小鼠主动脉根部，通过组织化学染色和免疫印迹(Western blot)检测ILF3蛋白表达水平，发现随着Apoe-/-小鼠高脂喂养时间增加及动脉粥样硬化斑块的加重，血管ILF3蛋白的表达水平显著升高。
上述两项结果均表明在人体和小鼠动脉粥样硬化模型中，ILF3蛋白表达水平随着动脉粥样硬化程度的加重呈现显著的升高，提示ILF3的表达变化参与动脉粥样硬化的发生和发展。
4.2ILF3在动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞中显著高表达
通过免疫荧光检测发现:ILF3与巨噬细胞存在着明显的共定位现象;体外实验也证明ox-LDL刺激后，巨噬细胞ILF3蛋白的表达水平显著升高。
4.3巨噬细胞ILF3激活促进动脉粥样硬化斑块的形成并加剧斑块不稳定性
对小鼠主动脉根部染色并分析后发现:巨噬细胞ILF3的高表达可促进动脉粥样硬化斑块的形成，并使斑块的易损性增加;而抑制巨噬细胞ILF3的激活，可显著逆转这一现象。
4.4转录组测序和蛋白质组测序联合分析提示巨噬细胞ILF3活化与脂代谢及免疫炎症反应密切相关
通过对巨噬细胞进行转录组测序和蛋白质组测序分析，明确了ILF3活化与脂肪消化吸收及炎症反应等代谢途径相关，且与PI3K/AKT，MAPK和Rap1等信号通路密切相关。
4.5巨噬细胞ILF3活化促进斑块内脂质所致炎症微环境
巨噬细胞ILF3敲除可显著抑制泡沫细胞的形成，而巨噬细胞ILF3的过度表达则可促进泡沫细胞形成;小鼠主动脉根染色证实了巨噬细胞ILF3高表达可增加斑块内炎症因子表达，而巨噬细胞ILF3的敲降则可抑制炎症的产生。
5.结论
(1)ILF3在动脉粥样硬化斑块巨噬细胞中高表达，参与动脉粥样硬化斑块的形成与发展。
(2)抑制巨噬细胞ILF3活化可显著减缓动脉粥样硬化斑块的形成，并增加动脉粥样硬化斑块的稳定性;而巨噬细胞ILF3高表达则可促进动脉粥样硬化的发生和发展。
(3)巨噬细胞ILF3通过介导脂质驱动的炎症反应促进动脉粥样硬化斑块的发生与发展。
论文Ⅱ巨噬细胞ILF3影响脂质介导炎症微环境的分子机制研究
1.研究背景
动脉粥样硬化是一种由内皮损伤、脂质沉积和氧化应激引起的炎症性疾病，其特点是动脉壁内泡沫细胞聚集。泡沫细胞的形成是由于巨噬细胞脂质摄取过多和胆固醇代谢功能异常所致。除了过度的泡沫细胞堆积，巨噬细胞介导的炎症反应是动脉粥样硬化病变的另一个主要因素。在动脉粥样硬化的发生和发展中，巨噬细胞具有独特的双重功能——调节脂质积累和代谢，并维持慢性炎症反应，这两种途径与急性冠脉综合征的发病机制密切相关。血管巨噬细胞是高度不均匀的可塑细胞，在动脉粥样硬化形成的所有阶段，从坏死核心形成到斑块破裂，都发挥着重要作用。近年来，巨噬细胞极化被证明在炎症反应的调节中起着至关重要的作用。一般说来，巨噬细胞主要分化为两种表型:一是经典途径激活的促炎型巨噬细胞(M1型巨噬细胞)，另一种是非经典通路激活的抗炎型巨噬细胞(M2型巨噬细胞)。最近的研究数据表明在人类斑块中M2型巨噬细胞可导致斑块的消退。与此同时，小鼠的动脉粥样硬化实验模型也发现，在斑块消退过程中会出现M1型巨噬细胞减少和M2型巨噬细胞富集的现象，并且，有文章报道M2型巨噬细胞在抑制小鼠动脉粥样硬化进展中起着重要的正性作用。靶向抑制巨噬细胞M1型极化被认为是预防动脉粥样硬化发展的可行途径。
我们前面的研究已经证明巨噬细胞ILF3脂代谢异常的条件下，对动脉粥样硬化斑块的形成和稳定性有重要的调节作用，但具体机制仍未阐明。本研究利用巨噬细胞ILF3特异性敲除小鼠的巨噬细胞，通过转录组-蛋白质组学测序联合分析明确ILF3基因的调节靶点，并利用免疫沉淀-质谱检测分析与ILF3相互作用的蛋白，探究巨噬细胞ILF3对巨噬细胞极化以及炎症反应的相关细胞及分子机制，为临床寻找动脉粥样硬化可能的治疗靶点提供理论依据。
2.目的
(1)探讨巨噬细胞ILF3的调控靶点及对动脉粥样硬化斑块形成的相关机制;
(2)探讨巨噬细胞ILF3在脂代谢异常环境下的相互作用蛋白的变化及对动脉粥样硬化斑块形成的相关机制;
(3)揭示巨噬细胞ILF3介导斑块内巨噬细胞极化调控斑块炎症微环境的分子机制;
3.方法
3.1巨噬细胞分离培养
利用8～10周龄的ILF3M-WT、ILF3M-KO和ILF3M-Tg小鼠，在腹腔注射6％淀粉无菌混悬液后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)收集腹腔巨噬细胞，在添加10％牛血清、100U/mL链霉素和100U/mL青霉素的RPMI培养基中培养。
收集的腹腔巨噬细胞后续用于脂质吞噬实验、流式细胞术、RT-PCR或免疫沉淀质谱。
3.2RNA免疫沉淀反应(RIP)
按照MagnaRIPRNA-BindingProteinImmunoprecipitation试剂盒(Millipore，Billerica，MA，USA)要求进行RIP检测。用抗体包括抗ILF3抗体(Proteintech，Chicago，IL，USA)和IgG抗体L沉淀mRNA。最终用qRT-PCR进行分析，结果显示目标mRNA在免疫沉淀和Input组之间的倍数变化。
3.3mRNA稳定性分析和qRT-PCR
用放线菌素D(10 mg/mL)处理巨噬细胞0、2、4、8、12和24小时。样品悬浮在TRIzol试剂(Invitrogen #15596018)中。根据RNeasyMini试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)使用说明，从细胞中分离总RNA。使用带有gDNAerase(Perfect Real Time)的PrimeScriptRT试剂试剂盒(Takara，Japan)对总RNA进行逆转录，使用LightCycler480SYBRGreenⅠMaster(Roche Life Science，NSW，Australia)进行qRT-PCR。每个转录本的表达利用对照基因β-actin进行归一化处理以显示相对于对照样本的表达变化。
3.4免疫印迹(Western blot)
提取组织标本蛋白和细胞蛋白，经BCA法检测蛋白浓度后，通过SDS-PAGE电泳及相应抗体孵育检测蛋白表达含量。
3.5流式细胞术
腹腔巨噬细胞经50μg/mLoxLDL处理后，用M1和M2亚型的标志物对细胞进行标记，将标记的细胞清洗、收集并使用FACS流式细胞仪系统进行分析。
3.6免疫沉淀-质谱联合分析
如前所述，从C57BL/6小鼠腹腔中分离巨噬细胞。在1mL培养基中加入或不加入oxLDL(50μg/mL)孵育24小时。使用免疫沉淀试剂盒进行免疫沉淀。利用Western-blot收集胶块进行质谱分析。
3.7统计数据
使用GraphPadPrism8(GraphPad Software)和Rv3.5.0(R Foundation for Statistical Computing，Vienna，Austria)以及ggplot2软件包9，10进行统计分析。验证数据的正态分布后，对两组数据进行t检验，对三组或更多组进行单因素方差分析(Tukeys post test)评估统计差异。对于有两个自变量的数据，采用双因素方差分析和Bonferroni后测。所有检验均为双侧检验，p＜0.05为有统计学意义。
4.结果
4.1转录组和蛋白质组联合分析提示巨噬细胞ILF3基因的表达变化与脂代谢异常及炎症免疫反应密切相关
通过对巨噬细胞转录组学的测序和蛋白质组学测序的联合分析，我们明确了ILF3基因的表达变化与脂代谢及免疫炎症反应等相关途径密切关联，且与CD36、Arginase1(Arg1)、MMPs等相关基因的表达调控密切相关。
4.2巨噬细胞ILF3敲除通过调节脂代谢抑制泡沫细胞的形成
ILF3M-WTApoE-/-，ILF3M-KOApoE-/-和ILF3M-TgApoE-/-小鼠，高脂喂养16周后，血清学检测发现:与ILF3M-WTApoE-/-相比，ILF3敲除组(ILF3M-KO ApoE-/-)小鼠血清中胆固醇(Cholesterol，CHO)和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)水平显著下降，而ILF3过表达小鼠组(ILF3M-Tg ApoE-/-)血清中胆固醇(CHO)和低密度脂蛋白(LDL)水平显著升高。提取各组小鼠腹腔巨噬细胞进行油红O染色发现:与对照组相比，ILF3敲除后，巨噬细胞摄取ox-LDL的能力显著降低，而过表达ILF3的巨噬细胞对ox-LDL摄取显著增强。
4.3巨噬细胞ILF3介导巨噬细胞极化，调节巨噬细胞的炎症因子分泌
体外诱导巨噬细胞分化发现:巨噬细胞ILF3的激活促进巨噬细胞向M1型转化，ILF3基因敲除，可显著抑制LPS和ox-LDL诱导的巨噬细胞向M1型转化。同时巨噬细胞ILF3基因敲除显著降低白细胞介素6(Interleukin 6，IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TumorNecrosisFactor-α，TNF-α)等炎症因子的释放。ILF3过度表达则可促进LPS和ox-LDL诱导的巨噬细胞向M1型转分化及炎症因子的分泌。
4.4巨噬细胞ILF3通过ILF3-Rap1A/ERK/AP-1途径调节脂质介导的炎症反应
通过对腹腔巨噬细胞进行IP-MS分析，我们明确了在ox-LDL处理下，巨噬细胞内ILF3可与Rap1A特异性结合且存在正性反馈作用。此外，我们也首次证明了ILF3-Rap1A的正反馈可促进MAPK通路的激活并增强C-FOS和C-Jun(激活蛋白-1[AP-1]的两个亚基)的活性从而促进炎症反应。
4.5巨噬细胞ILF3通过调节Arg1mRNA的稳定性影响巨噬细胞极化
利用RNA免疫沉淀我们确认了ILF3和Arg1mRNA之间的相互作用。RIP-PCR分析证明了ox-LDL可促进ILF3与Arg1mRNA的结合;且ILF3与Arg1mRNA的结合可促进巨噬细胞Arg1mRNA的降解。
5.结论
(1)揭示了巨噬细胞ILF3缺失可抑制泡沫细胞形成;
(2)阐明了巨噬细胞ILF3可促进斑块内巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化;
(3)揭示了巨噬细胞ILF3通过ILF3-Rap1A/ERK/AP-1途径以及Arg1mRNA的稳定性影响巨噬细胞内的炎症反应。