Bt毒蛋白免疫检测试剂盒的制备及应用

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本文从苏云金杆菌HD—1、HD—73、304A(b)于171K EM~+三个菌株经发酵培养制备了胞晶混合物,胞晶混合物经液体双向法分离出伴胞晶体,伴胞晶体经等电点沉淀纯化出CryIA、CryIA(c)、CrylA(b)三种杀虫晶体蛋白。用CryIA、CryIA(c)、CryIA(b)杀虫晶体蛋白制备出三种兔抗血清,其中抗CryIA的双扩效价为1/32,抗CryIA(c)、CryIA(b)的双扩效价为1/16。三种抗血清的ELISA效价分别为>1/100000、>1/100000、>1/100000。抗血清经辛酸—硫酸铵法沉淀,再用离子交换柱纯化后,分别用生物素和辣根过氧化物酶标记。用CryIA杀虫晶体蛋白免疫小鼠制备单抗,筛选出了11个单克隆株系。在用样品进行抗体特异性检测后,仅有一个单克隆株系B4E6D8和抗CryIA、CryIA(c)多抗的特异性高,用所纯化和标记的抗体建立了三种检测转Bt基因抗虫棉花的毒蛋白检测试剂盒,检测极限均达到1个ng/ml以下。用所制备的试剂盒对中国农科院植保所、中国农科院棉花所、南京农业大学、邯郸市农科院棉花所的大量抗虫棉花样品进行了盲测,所有测定都正确找出了阴性对照,阳性测定结果与田间表现完全一致。本试剂盒的质量完全达到了国际同类水平,其开发成功,对于我国的抗虫棉花、玉米、水稻的杂交育种工作提供了强有力的手段。对转Bt作物的安全运用以及种子质量监测都会起到巨大的作用。
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