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背景:关节软骨损伤临床发病率越来越高,正被人们高度关注。由于正常透明软骨是一种特殊组织,无血管、神经,损伤后其自我修复能力低下,直径超过4mm的软骨缺损不能完全自我修复。软骨损伤后,会导致关节肿胀和疼痛,影响运动功能,不及时治疗,最终发展为骨性关节炎。传统治疗关节软骨缺损的方法有:微骨折技术、自体/异体骨软骨移植技术等,但都存在一定的缺陷和不足。随着组织工程技术的发展,自体软骨细胞移植(ACI)技术在临床得到应用,并取得明显治疗效果,但还是存在明显缺陷:首先软骨细胞体外培养、扩增,难以模拟在体微环境,缺乏机体免疫系统的监控,植入的软骨细胞通常已经发生表型改变,最终形成的修复组织无论在结构上还是成份上都与天然软骨存在本质差异,其次该方法需要二次手术植入修复缺损,治疗期限跨度长,身体损伤大,给患者带来巨大身体痛苦和经济负担。目的:本研究利用组织工程技术体外构建组织工程软骨,无菌条件下取贵州小香猪膝关节软骨,制作成软骨微粒,体外培养后观察软骨微粒中软骨细胞脱落、增殖情况,筛选最佳增殖效果的粒径范围,然后用增殖效果最佳的软骨微粒作为种子细胞;制备Ⅱ型胶原蛋白、硫酸软骨素、透明质酸(COLⅡ/CS/HA)仿生基质凝胶,加入EDAC交联剂,升温成凝胶后,检测其成胶性能;用软骨微粒与仿生基质溶胶混合后体外共培养,通过大体和组织学检测,评估体外构建组织工程软骨的可行性。本实验成功后,可望为一次手术治疗关节软骨缺损提供依据。方法:取3-5月龄贵州小香猪膝关节,把软骨制成微粒状;将微粒用孔径分别为120μm、212μm、475μm、880μm微粒筛过滤;收集不同粒径的软骨微粒,按粒径由小至大设A、B、C、D组,保证每组质量相同,均匀种植到3个12孔培养板中,用高糖培养基培养;培养1d、3d、7d时,分别取出1板进行细胞计数,筛选脱落、增殖效果最佳的粒径范围。用环钻在离体新鲜猪膝关节上制备直径8mm全厚软骨缺损模型;将COLⅡ/CS/HA配制成终浓度10mg/ml复合仿生基质溶胶,取3ml调至中性,加入EDAC20μl搅拌均匀;用1ml注射器吸入中性复合胶并注入软骨缺损模型,放入37℃孵箱,6min后观察成凝胶情况;设计软骨微粒获取装置,包括主机、刨头、踏板;利用装置获取软骨微粒在100-120μm之间,符合最佳增殖粒径标准;COLⅡ/CS/HA按质量比8:1.5:0.5溶于0.15mol/lHCL中,取3ml调至中性备用;软骨微粒按5×104个/ml与COLⅡ/CS/HA溶胶混合,加入EDAC20μl搅拌均匀,注入软骨缺损模型中,升温6min成凝胶后,放入高糖培养基中培养,1周后进行大体,免疫荧光和组织学观察。结果:制备的软骨微粒即刻显微镜观察软骨细胞分布均匀,呈强折光性,可见部分软骨陷窝被切开;培养1d各组微粒均有少量细胞脱落;3d时可见较多软骨细胞从软骨微粒中脱落、增殖;7d时大量软骨细胞脱落、增殖,几乎长满板底,贴壁并呈长条状。在3个时间点对各组软骨细胞脱落、增殖情况计数,A组较B、C、D组软骨细胞增殖好,差异均有统计学意义(P<0.05),最佳增殖粒径为小于120μm的软骨微粒;制备的仿生基质溶胶3ml,加入EDAC20μl交联剂后低温下呈溶胶状,具有流动性,升温一定时间后,变成凝胶状,弹性、强度良好;软骨微粒复合仿生基质溶胶体外共培养1W,大体观察见:外观呈淡红色,培养基充分浸入基质中,触之表面光滑并具有一定的弹性和强度;免疫荧光示:软骨微粒中的软骨细胞及脱落、增殖的软骨细胞成活良好;HE染色示:软骨微粒均匀分散于凝胶中,软骨微粒中软骨细胞存活良好;阿尔新兰染色示:软骨细胞从微粒中脱落、增殖并扩散至周围基质中;天狼猩红染色偏振光示:软骨微粒与凝胶基质融合良好,且成份基本相同。结论:软骨微粒体外培养完全可以存活,不同粒径的软骨微粒均有软骨细胞脱落、增殖。证实粒径小于120μm增殖效果最好,粒径越小切开软骨陷窝的机率大,细胞从微粒中脱落就多,此方法获取的软骨微粒作为组织工程软骨种子细胞来源具有可行性;COLⅡ/CS/HA仿生基质溶胶加入EDAC交联剂后利用温控相变原理,6min能够由溶胶成凝胶,且凝胶弹性、强度好,具备植入体内缺损处的初始稳定性,满足作为支架材料要求;软骨微粒复合仿生基质溶胶体外共培养,混合物中有大量软骨细胞脱落、增殖,软骨微粒与基质融合较好,体外成软骨具有可行性,辅以最佳的在体培养增殖环境,能形成透明软骨,是修复关节软骨缺损一种新方法。