【摘 要】
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目的:本研究旨在探讨TSPAN3在非小细胞肺癌（NSCLC,Non-small Cell Lung Cancer）中的表达及其临床病理意义,探究TSPAN3对NSCLC细胞增殖能力的影响及分子机制。阐明TSPAN3对β1整合素细胞内循环的调控机制。研究方法:构建和转染TSPAN3质粒和si RNA序列,TSPAN3的LEL结构域突变质粒,采用激光共聚焦实验明确TSPAN3与β1整合素及Rab11a
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目的:本研究旨在探讨TSPAN3在非小细胞肺癌（NSCLC,Non-small Cell Lung Cancer）中的表达及其临床病理意义,探究TSPAN3对NSCLC细胞增殖能力的影响及分子机制。阐明TSPAN3对β1整合素细胞内循环的调控机制。研究方法:构建和转染TSPAN3质粒和si RNA序列,TSPAN3的LEL结构域突变质粒,采用激光共聚焦实验明确TSPAN3与β1整合素及Rab11a相互作用关系;采用Western Blot,观察转染突变体质粒、共转染TSPAN3质粒及Rab11a干扰序列后,对整合素、下游FAK-MAPK通路活性的影响,及下游靶基因表达的改变;通过免疫荧光、流式细胞术等方法,检测上述改变对β1整合素亚细胞定位及细胞膜上整合素水平的影响。结果:1.TSPAN3的高表达与非小细胞肺癌患者的不良预后相关,Kaplan-Meier生存分析显示。TSPAN3高表达的肺癌患者术后生存期明显短于TSPAN3低表达的肺癌患者。2.免疫共沉淀实验显示TSPAN3可与β1整合素相互作用,并且这一相互作用依赖其LEL结构域。Western Blot实验结果显示野生型TSPAN3可上调β1整合素的蛋白水平,而LEL结构域缺失的突变体则不能。免疫组化结果显示在肺癌组织中TSPAN3与β1整合素表达水平呈正相关。3.MTS和集落形成实验表明TSPAN3可促进非小细胞肺癌的增殖能力。Western Blot实验结果显示野生型TSPAN3可促进β1整合素下游信号通路的激活,而LEL结构域缺失的突变体则不能。4.PCR实验表明TSPAN3并不影响β1整合素的m RNA水平,共聚焦免疫荧光显示TSPAN3参与β1整合素的循环。流式检测结果显示干扰TSPAN3表达后,β1整合素返回细胞膜的效率明显下降。5.质谱分析、免疫共沉淀及共聚焦免疫荧光均表明TSPAN3与Rab11a存在相互作用,并且两者的共定位变化与β1整合素的循环过程存在时空上的重合。干扰TSPAN3表达后,共聚焦免疫荧光结果显示,β1整合素与Rab11a的共定位水平明显降低。Western Blot实验结果显示,共转染TSPAN3过表达质粒和Rab11a干扰序列后,TSPAN3对β1整合素蛋白水平及下游信号通路的激活作用不同程度地被Rab11a的敲减逆转。结论:1.TSPAN3在NSCLC细胞及组织中高表达,且与肺癌患者不良预后相关;2.TSPAN3促使β1整合素锚定于Rab11a循环内体而促进其循环;3.TSPAN3促进β1整合素循环上调其总量,进而促进NSCLC细胞的增殖能力。
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