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目的：本实验通过不同浓度的KCl不同时间点作用于PC12细胞，观察细胞活力的变化，选取KCl诱导PC12细胞损伤模拟神经细胞钙超载的损伤；通过对PC12细胞形态及细胞存活率的观察，探讨六味地黄丸含药血清对PC12细胞的保护作用；通过对细胞内钙荧光强度变化的观察，观察六味地黄丸含药血清对细胞内钙离子浓度的影响；通过对CaMKII、CREB、BDNF mRNA和蛋白水平表达的测定，探讨六味地黄丸含药血清对Ca2+-CaMKII-CREB-BDNF信号通路的影响。为六味地黄丸用于防治神经细胞内钙超载提供科学的实验数据与理论基础，初步探讨六味地黄丸对神经细胞保护作用的分子机制。材料与方法：按照随机数字法将雄性SD大鼠分为2组，即正常组、六味地黄丸组。六味地黄丸组，将生药浓度为0.75kg/L药液，按10mL/kg灌胃，每天2次，正常组给予同体积双蒸水灌胃，连续给药4天，第5天首次给药1.5h后腹主动脉取血，静置2h，2000r/min离心10min后分离血清。经56℃，30min灭活，0.22μm滤膜过滤灭菌，-20℃保存备用。取培养瓶中处于对数生长期的PC12细胞，经0.25%胰蛋白酶于37℃消化，加入含10%胎牛血清的DMEM完全培养液，细胞密度1×105/mL，37℃，5%CO2下继续培养12h后，细胞贴壁生长，换用无血清的DMEM培养液继续培养12h后用于实验。配置浓度为50、100、150、200mmol/L的KCl，分别损伤10、20、30min后采用MTT法检测PC12细胞的活性，依据时间短、损伤小但钙超载模型成功的原则选取KCl的浓度。将PC12细胞分为六组：（1）空白对照组：10%空白血清；（2）模型组：10%空白血清+150mmol/L KCl；（3）中药干预组：10%六味血清+150mmol/L KCl；（4）西药干预组：10%空白血清+尼莫地平10umol/L+150mmol/L KCl；（5）预干预模型组：10%空白血清（预干预48h）+150mmol/L KCl；（6）预干预中药组：10%六味血清（预干预48h）+150mmol/L KCl。（2）、（3）和（4）组是含有胎牛血清的DMEM中培养48小时后，PBS洗2遍后药物血清与KCl同时加入，作用20min后用PBS洗2遍后加入对应血清及药物继续培养6h；（5）和（6）组是预干预48h后加KCl，作用20min后用PBS洗2遍后加入无血清DMEM继续培养6h。倒置显微镜下观察各组细胞形态，MTT法测定细胞存活率，细胞上清液中LDH活性测定。各组细胞经Fluo-3的负载后激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子平均荧光强度。各组细胞内总RNA的提取和RT-PCR法检测CaMKII、CREB、BDNF的mRNA表达。各组细胞爬片经固定后，SABC法检测细胞CaMKII、CREB、BDNF的蛋白表达。收集细胞，提取各组细胞总蛋白，western blot法检测CaMKII、CREB、BDNF的蛋白表达。结果：1KCl诱导细胞损伤模型建立统计结果显示：与对照组比较，150mmol/L、200mmol/L的KCl作用20min后细胞活力明显性降低（P<0.05），100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L的KCl作用30min细胞活力明显性降低（P<0.05）。2六味地黄丸含药血清对KCl诱导PC12细胞损伤的影响2.1形态学观察倒置显微镜下，空白对照组细胞呈梭形，胞间接触紧密，并伸出伪足，伪足有交错，增殖旺盛，折光度强；模型组、预干预模型组细胞伪足大部分消失，折光度减弱，部分细胞皱缩、变圆、脱落，漂浮于培养基中；中药干预组和西药干预组，细胞肿胀，少数折光度减弱，少数细胞脱落；预干预中药组细胞折光度强，细胞增殖旺盛。2.2KCl损伤后对各组细胞活力（MTT）的影响与空白对照组比较，模型组细胞存活率显著降低（P<0.01），预干预模型组、中药干预组和西药干预组细胞存活率明显降低（P<0.05）；与模型组相比，中药干预组和西药干预组细胞存活率明显提高（P<0.05）；与预干预模型组相比，预干预中药组细胞存活率显著提高（P<0.01）。2.3KCl损伤对各组细胞上清液中LDH活力的影响与空白对照组比较，模型组细胞上清液中LDH活力显著提高（P<0.01），预干预模型组、中药干预组和西药干预组细胞上清液中LDH活力明显提高（P<0.05）；与模型组相比，中药干预组和西药干预组细上清液中LDH活力明显降低（P<0.05）；与预干预模型组相比，预干预中药组细胞上清液中LDH活力明显降低（P<0.05）。3六味地黄丸含药血清对细胞内游离钙浓度的影响激光共聚焦观察细胞内钙荧光强度的变化，统计结果显示：静息时，预干预中药组细胞内钙离子平均荧光强度明显低于空白对照组、模型组、中药干预组、西药干预组、预干预模型组（P<0.05），其余各组间无显著性差异；动态时，与空白对照组相比，模型组、中药干预组、西药干预组、预干预模型组细胞内钙荧光强度显著性增高（P<0.01），与模型组相比，中药干预组细胞内钙荧光强度明显降低（P<0.05），西药干预组细胞内钙荧光强度显著性降低（P<0.01），与预干预模型组相比，预干预中药组细胞内钙荧光强度显著性降低（P<0.01），与中药干预组相比，预干预中药组细胞内钙荧光强度显著性降低（P<0.01）；与静息时比较，动态时模型组、中药干预组、西药干预组、预干预模型组细胞内钙荧光强度显著性增高（P<0.01），动态时预干预中药组胞内钙荧光强度明显增高（P<0.05）。4六味地黄丸含药血清对信号通路中CaMKII、CREB、BDNF的影响4.1各组细胞CaMKII、CREB、BDNF mRNA表达的变化统计结果显示：与空白对照组相比，模型组、中药干预组、西药干预组、预干预模型组、预干预中药组的CaMKII mRNA表达显著性降低（P<0.01），与模型组相比，中药干预组、西药干预组的CaMKII mRNA表达显著性增高（P<0.01），预干预模型组相比，预干预中药组的CaMKII mRNA表达显著性增高（P<0.01）；与空白对照组相比，模型组、中药干预组CREB mRNA表达显著性降低（P<0.01），西药干预组CREB mRNA表达明显降低（P<0.05），与模型组相比，中药干预组CREB mRNA表达明显增高（P<0.05），西药干预组CREB mRNA表达显著增高（P<0.01），与预干预模型组相比，预干预中药组CREB mRNA表达显著增高（P<0.01），与中药干预组相比，预干预中药组CREB mRNA表达明显增高（P<0.05）；与空白对照组相比，模型组、预干预模型组的BDNF mRNA表达显著性降低（P<0.01），中药干预组、西药干预组的BDNF mRNA表达明显降低（P<0.05），与模型组相比，中药干预组BDNF mRNA表达明显增高（P<0.05），西药干预组BDNF mRNA表达显著增高（P<0.01），与预干预模型组相比，预干预中药组BDNF mRNA表达显著增高（P<0.01），与中药干预组相比，预干预中药组BDNF mRNA表达显著增高（P<0.01），与西药干预组相比，预干预中药组BDNFmRNA表达明显增高（P<0.05）。4.2各组细胞CaMKII、CREB、BDNF蛋白表达的变化4.2.1SABC免疫组化法检测统计结果统计结果显示：与空白对照组相比，模型组、中药干预组、西药干预组、预干预模型组CaMKII蛋白表达显著降低（P<0.01），与模型组相比，中药干预组、西药干预组CaMKII蛋白表达显著增高（P<0.01），预干预模型组相比，预干预中药组的CaMKII蛋白表达显著增高（P<0.01），与中药干预组相比，预干预中药组的CaMKII蛋白表达显著增高（P<0.01），与西药干预组相比，预干预中药组的CaMKII蛋白表达显著增高（P<0.01）；与空白对照组相比，模型组、中药干预组、西药干预组、预干预模型组、预干预中药组的CREB蛋白表达显著降低（P<0.01），与模型组相比，中药干预组、西药干预组的CREB蛋白表达显著增高（P<0.01），与预干预模型组相比，预干预中药组的CREB蛋白表达显著增高（P<0.01），与中药干预组相比，预干预中药组的CREB蛋白表达显著增高（P<0.01）；与空白对照组相比，模型组、中药干预组、西药干预组、预干预模型组BDNF蛋白表达显著降低（P<0.01），与模型组相比，中药干预组、西药干预组的BDNF蛋白表达显著增高（P<0.01），预干预模型组相比，预干预中药组的BDNF蛋白表达显著增高（P<0.01），与中药干预组相比，预干预中药组的BDNF蛋白表达明显增高（P<0.05），与西药干预组相比，预干预中药组的BDNF蛋白表达明显增高（P<0.05）。4.2.2western blot法检测统计结果统计结果显示：与空白对照组相比，模型组、中药干预组、西药干预组、预干预模型组CaMKII蛋白表达显著降低（P<0.01），与模型组相比，中药干预组、西药干预组的CaMKII蛋白表达显著增高（P<0.01），预干预模型组相比，预干预中药组的CaMKII蛋白表达显著增高（P<0.01），与中药干预组相比，预干预中药组的CaMKII蛋白表达显著增高（P<0.01），与西药干预组相比，预干预中药组的CaMKII蛋白表达显著增高（P<0.01）；与空白对照组相比，模型组、预干预模型组CREB蛋白表达显著降低（P<0.01），中药干预组、西药干预组CREB蛋白表达明显降低（P<0.05），与模型组相比，中药干预组、西药干预组的CREB蛋白表达显著增高（P<0.01），与预干预模型组相比，预干预中药组的CREB蛋白表达显著增高（P<0.01），与中药干预组、西药干预组相比，预干预中药组的CREB蛋白表达明显增高（P<0.05）；与空白对照组相比，模型组、中药干预组、西药干预组、预干预模型组BDNF蛋白表达显著降低（P<0.01），与模型组相比，中药干预组、西药干预组的BDNF蛋白表达显著增高（P<0.01），与预干预模型组相比，预干预中药组的BDNF蛋白表达显著增高（P<0.01），与中药干预组、西药干预组相比，预干预中药组的BDNF蛋白表达显著增高（P<0.01）。结论：1不同浓度的KCl不同时间点作用于PC12细胞后，随着KCl的浓度加大及作用时间延长，细胞活力逐渐减弱，即KCl对细胞的损伤程度呈剂量-时间依赖性。最终选取150mmol/LKCl作为细胞损伤浓度，模拟神经细胞钙超载损伤状态；2六味地黄丸含药血清可提高PC12细胞的活力；3六味地黄丸含药血清可明显降低细胞内钙离子浓度，维持和调节细胞内钙稳态；4六味地黄丸含药血清可显著提高信号通路中CaMKII、CREB、BDNF的mRNA和蛋白表达。