【摘 要】
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肌氨酸氧化酶（sacrosine oxidase,SOX）是一种能催化肌氨酸生成甲醛、过氧化氢和甘氨酸的黄素蛋白氧化酶,在医疗和食品等领域均有应用,具备重大经济价值。但目前大部分SOX存在热稳定性差、表达量低等问题,使SOX应用受限。本研究从来源于古生菌Archaea HR32预测的SOX出发,研究内容主要涉及酶蛋白的异源表达与纯化、酶学性质探究、发酵优化及重组蛋白r SOX的固定化研究。研究结果
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肌氨酸氧化酶（sacrosine oxidase,SOX）是一种能催化肌氨酸生成甲醛、过氧化氢和甘氨酸的黄素蛋白氧化酶,在医疗和食品等领域均有应用,具备重大经济价值。但目前大部分SOX存在热稳定性差、表达量低等问题,使SOX应用受限。本研究从来源于古生菌Archaea HR32预测的SOX出发,研究内容主要涉及酶蛋白的异源表达与纯化、酶学性质探究、发酵优化及重组蛋白r SOX的固定化研究。研究结果如下:（1）通过更换不同的表达体系,首次实现了古生菌Archaea HR32来源的肌氨酸氧化酶基因在Bacillus subtilis WB600中的可溶性表达。细胞破碎液经热处理之后,再通过镍柱亲和层析获得纯酶。相关酶学性质研究发现:重组蛋白r SOX大小约为42 k Da,二级结构包含35.0%α-螺旋、11.1%β-折叠、23.3%β-转角及31.6%无规则卷曲,Tm和ΔH为92.13℃和1070 k J·mol-1。以肌氨酸为底物时,最适反应p H为8.0,最适反应温度为70℃,80℃半衰期为12 h,Km、kcat和kcat/Km分别为1.17 mmol·L-1,74.59 min-1,63.78 L·（mmol·min）-1。常见有机溶剂对r SOX活性影响不大,金属离子则对r SOX有不同程度的促进或抑制作用。另外,r SOX还可催化降解其他多种N-甲基类化合物,且对N-甲基-L-型底物有明显的手性选择性。（2）经过单因素优化和正交实验,确定发酵培养基组成。在摇瓶水平进行发酵条件优化,确定最佳发酵条件为:37℃,200 r·min-1,初始培养基p H为7.5,装液量35 m L,10%接种量,培养6 h后添加1.5%木糖诱导剂,发酵24 h。优化后,粗酶酶活达17.2 U·L-1,是优化前的5.9倍,粗酶经热处理后总酶活提高了96%,1 L发酵液可产14.7 mg目的蛋白,比酶活为2.3 U·mg-1。（3）为进一步提高r SOX的表达量,在5 L发酵罐上对发酵工艺和补料条件进行优化,确定发酵条件为:溶氧30%,分阶段控制p H,前10 h控制p H为7.0,后期控p H为8.0,6 h开始按3.5 g·（L·h）-1恒速流加葡萄糖。下罐时粗酶酶活达93.9 U·L-1,热处理后酶活达184.0 U·L-1,是摇瓶水平的5.46倍,是初始酶活的63倍,1 L发酵液可产80.2 mg的目的蛋白,表达量有了较大幅度的提升。（4）对固定化方法进行筛选,确定最佳固定化载体为磁性壳聚糖微球。经制备条件与固定化条件优化后,最大载酶量为40 mg·g-1,最大酶活保留率为44.3%。考察固定化r SOX的酶学性质发现:最适反应温度较游离酶下降10℃,热稳定性也有所下降,最适p H往碱性偏移,p H适应性较游离酶更宽泛,固定化后对肌氨酸的亲和力下降。重复操作实验表明,磁性壳聚糖微球固定化酶具备优良的操作稳定性,在使用15次后仍可保留85%左右的酶活。
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