论文部分内容阅读
慢性应激在动物疾病的发生、进展中有不可忽视的危害,甚至会对动物的生命造成威胁。慢性应激发生时,各器官都会发生损伤,肠道则是其中极其易受损伤的器官,而十二指肠又是铁这一生命必要元素的主要吸收部位。当十二指肠遭受慢性应激损伤时,机体铁稳态被打破,引发各种疾病,甚至可能诱发铁死亡,从而导致肠道损伤,进而影响机体对营养物质的吸收,严重降低了动物的经济价值。因此明确慢性应激致肠道铁死亡的相关机制及探寻适当的保护药物对于兽医临床研究有着十分重要的意义。绿原酸有抗炎、抗氧化等作用,对肠道也有一定保护作用。因此本研究通过建立大鼠慢性应激模型,并探究绿原酸对慢性应激致大鼠十二指肠损伤的保护效果,同时利用STAT3抑制剂,进一步明确其保护机制,为今后开展慢性应激相关疾病的防治奠定基础。试验中选用56只健康的雄性Wistar大鼠,随机分为7组,分别为空白（CON）组、慢性应激（CS）组、空白给药组（Cga+CON）组、模型给药（Cga+CS）组、空白+抑制剂（S3I-201+CON）组、模型+抑制剂（S3I-201+CS）组及溶剂对照（DMSO+CS）组。其中CS组、Cga+CS组、S3I-201+CS组、DMSO+CS组在21天内每天进行6 h的束缚应激,对Cga+CON组及Cga+CS组每日造模前1 h灌胃给予绿原酸,对S3I-201+CON组、S3I-201+CS组及DMSO+CS组每隔2 d在束缚前1 h进行腹腔注射给予相应药物。模型建立期间每3 d称量一次体重,模型建立结束即开展旷场试验,检测后采血处死大鼠并取组织冻存。通过检测大鼠体重的变化、旷场试验结果、血清皮质酮含量综合判定大鼠慢性应激模型是否成功建立。通过观察十二指肠组织显微结构变化,检测血清、肝脏中铁调素相关通路指标的mRNA和蛋白表达量,检测十二指肠调节细胞内铁进出相关指标以及十二指肠中铁死亡相关指标的mRNA和蛋白表达量,组织铁含量及分布,进而明确慢性应激致十二指肠铁死亡的损伤作用机制以及绿原酸的保护作用机制。试验结果显示,CS组平均日增重显著低于CON组;相较于CON组,CS组大鼠更为焦虑、探索能力下降;与CON组相比CS组血清中的皮质酮水平显著升高（P＜0.01）。组织病理学结果显示,CS组鼠十二指肠绒毛结构紊乱;与CS组相比,S3I-201+CON组十二指肠损伤有所缓解。铁含量与铁分布染色结果显示,较CON组而言,CS组DMT1蛋白与mRNA表达不变而FPN1蛋白与mRNA表达显著降低（P＜0.01）,十二指肠组织中铁含量增加并在普鲁士蓝染色中可见明显铁沉积。铁死亡相关指标检测结果显示,与CON组相比,CS组十二指肠组织中MDA与ROS含量显著升高（P＜0.01）、GSH含量显著减少（P＜0.01）、GPX4蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）、Ptgs2 mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）、NADPH含量显著减少（P＜0.01）;与CS组相比,S3I-201+CON组十二指肠组织中MDA与ROS含量、GSH含量、GPX4蛋白表达水平、Ptgs2 mRNA表达水平、NADPH含量的异常变化均得到恢复。表明慢性应激会引起十二指肠铁稳态失衡诱发铁死亡并造成肠道损伤。对铁调素相关检测结果显示,与CON组相比,CS组血清铁调素含量及肝脏铁调素mRNA水平显著升高（P＜0.01）;与CS组相比S3I-201+CS组血清铁调素含量与肝脏铁调素mRNA水平均减少（P＜0.01）。IL-6相关检测结果显示,与CON组比,CS组血清IL-6含量、肝脏IL-6蛋白与mRNA水平都显著升高（P＜0.01）。STAT3通路相关检测结果显示,与CS组相比,S3I-201+CS组肝脏IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达量显著降低恢复正常水平,这表明STAT3是肝脏铁调素合成分泌的关键性基因,慢性应激能通过过度激活肝脏STAT3相关通路从而引起十二指肠铁死亡。施用绿原酸后,与CS组比较,大鼠十二指肠组织绒毛结构相对完整,大鼠血清IL-6、铁调素含量,肝脏铁调素mRNA表达水平显著下降（P＜0.01）,十二指肠DMT1与FPN1蛋白及mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）,十二指肠铁含量显著降低（P＜0.01）,普鲁士蓝染色未见明显铁沉积,十二指肠ROS与MDA含量显著降低（P＜0.01）、GPX4蛋白及mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）、GSH含量显著升高（P＜0.01）、Ptgs2 mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）、NADPH含量显著增加（P＜0.01）。表明绿原酸对慢性应激引起的十二指肠铁死亡有明显的缓解作用。综合各部分试验结果表明,慢性应激可引起大鼠机体IL-6水平升高,过度激活肝脏JAK2/STAT3通路,促进肝脏合成大量铁调素,作用于十二指肠引起铁稳态失衡,发生铁蓄积,进而诱导肠道铁死亡的发生;绿原酸可通过抑制肝脏IL-6/JAK2/STAT3通路降低铁调素合成分泌进而缓解慢性应激致大鼠十二指肠铁死亡。