【摘 要】
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衰老是水稻生长发育的必要阶段,水稻的早期衰老将致其产量和质量大幅降低,然而,水稻衰老的机制尚不清楚。为了深入研究水稻早衰的表达机制,本研究通过乙基甲磺酸(Ethyl Methane Sulfonate,EMS)诱变构建了一个突变体库,并从粳稻品种浙粳22中分离得到一株水稻早衰突变体材料,将该突变体暂命名为zj-es(Zhe Jing-early senescence)。本研究主要通过对突变体材料z
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衰老是水稻生长发育的必要阶段,水稻的早期衰老将致其产量和质量大幅降低,然而,水稻衰老的机制尚不清楚。为了深入研究水稻早衰的表达机制,本研究通过乙基甲磺酸(Ethyl Methane Sulfonate,EMS)诱变构建了一个突变体库,并从粳稻品种浙粳22中分离得到一株水稻早衰突变体材料,将该突变体暂命名为zj-es(Zhe Jing-early senescence)。本研究主要通过对突变体材料zj-es进行农艺性状及表型分析,并对zj-es的目标基因进行初步定位,最后通过全转录组学以及初步的功能分析进一步了解zj-es触发水稻早衰的分子机制。主要研究内容如下:1.突变体zj-es从苗期开始出现早衰表型,苗期时,zj-es叶片的倒二叶和倒三叶出现红褐色斑点,且植株株高降低,育性降低、干重、湿重、分蘖数、有效穗数、每穗粒数以及千粒重等农艺性状均表现为极显著性降低。透射电镜结果显示,zj-es的叶绿体呈现结构疏松,片层结构塌陷等特征。分蘖期时,zj-es的衰老程度逐渐加深,倒二叶和倒三叶的叶尖以及叶边缘呈枯萎状。成株期时,zj-es全株叶片褪绿萎黄,最后植株衰老枯死。2.遗传分析表明,zj-es的早衰性状由隐性单基因控制。通过图位克隆方法,将突变基因ZJ-ES初步定位于第3号染色体RM5992与RM5813之间,根据水稻基因组注释项目网站得出ZJ-ES基因两个分子标记之间的距离为458 kb,包含75个预测基因位点。这75个预测基因与已报导和已克隆的水稻早衰突变体基因皆不相同,说明ZJ-ES基因是一个水稻早衰新基因。3.全转录组结果显示,各比较组中共鉴定出10085个差异表达mRNA(DEmRNA)、1253个差异表达lncRNA(DElncRNAs)和614个差异表达miRNA(DEmiRNAs)。基于加权基因共表达网络分析(WGCNA),发现共表达的绿松石模块是水稻发生早衰的关键。ceRNA富集结果表明,差异表达的编码RNA和非编码RNA主要富集到代谢过程、生物过程调控、核酸结合转录因子活性、细胞器、膜和膜部分等生物过程以及自噬、过氧化物酶体、异噬、内吞、囊泡转运中的SNARE相互作用、泛素介导的蛋白酶体降解等信号通路,而且在这些通路中发现Os ATG4、Os ATG8a/b/c/d、Os Rab5c、Os Rab7B3等自噬相关基因存在显著差异表达。此外,竞争性内源RNA(Ce RNA)网络分析显示14个lncRNAs可能通过8个miRNAs调控16个共表达的mRNAs。因此,通过ceRNA可视化共表达网络图筛选到SEC61A、Os DET1、SODA、MLYCD等mRNAs,MSTRG.14864.2、MSTRG.13301.1、MSTRG.21623.1、MSTRG.28948.2等lncRNAs和miR5084-x、miR6108-z、miR4993-z等miRNAs作为关键的mRNAs和nc RNAs。我们运用qRT-PCR技术对全转录组的测序结果进行验证,结果表明,qRT-PCR显示的相对表达量趋势与测序结果一致。4.功能初步分析表明,SEC61A可能在叶绿体中发挥功能,Os DET1可能在细胞核及细胞外周中发挥功能,SODA和MLYCD可能在线粒体中发挥功能。另外,透射电镜结果表明,zj-es叶片中存在自噬体,说明zj-es早衰进程中存在自噬过程的参与。加之凋亡斑块的出现以及TB染色和MDA含量的测定都证明了PCD的产生,说明zj-es中自噬体的产生可能通过PCD触发早期衰老。此外,我们监测了zj-es的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平。DAB染色和ROS相关酶活性,如H2O2、GSH、SOD、POD和CAT等的测定结果表明,ROS产生系统作为一种刺激信号诱导了zj-es早衰。
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