针药并用对PCOS-IR大鼠卵巢颗粒细胞miRNA-106a/PTEN/AKT通路的影响

来源 :辽宁中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yczcjlk
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目的:本实验是以高脂饲料喂养联合来曲唑所致的多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗(P olycystic ovary syndrome with insulin resistance index,PCOS-IR)大鼠模型为研究对象,探讨针药并用对PCOS-IR大鼠卵巢形态及内分泌水平的影响;基于“固本化痰”的中医治疗思想,探讨针药并用治疗PCOS-IR大鼠的作用机制;探讨PCOS-IR大鼠卵巢颗粒细胞miRNA-106a/PTEN/AKT通路作为治疗PCOS-IR新靶向的可行性。材料与方法:选用健康SPF级雌性4-5周龄的SD大鼠53只,适应性喂养一周后按随机数表法将53只大鼠分为空白组(A)10只、造模组43只。A组给予普通饲料喂养,共12周,第4周开始每天用0.5%羧甲基纤维素钠溶液(CMC-Na溶液)灌胃,连续9周。造模组给予高脂饲料连续喂养12周,第4周开始每天用来曲唑溶液进行灌胃,连续灌胃9周进行PCOS-IR造模,通过阴道涂片观察阴道细胞学形态变化,判断大鼠动情周期是否有改变,若出现了动情间期延长则说明造模成功。将造模成功的造模组大鼠随机分为模型组(B)、中药组(C)、针刺组(D)以及针药组(E),C组采取中药灌胃,中药方剂为二陈汤加味,灌胃的剂量是1mg/100g/d,连续灌胃4周,D组进行针刺干预,针刺针选用0.18×10mm规格毫针,选穴为关元穴、子宫穴(双)、三阴交穴(双)、丰隆穴(双)、肾俞穴(双)、脾俞穴(双),每天针刺1次,留针20min,干预五天休息两天,共干预4周。E组进行灌胃加针刺的双重干预,针刺与灌胃的操作方法及时间与C组、D组相同。治疗结束后,观察大鼠动情周期;检测并计算各组大鼠体质量增长率;苏木素-伊红染色法(HE)观察大鼠卵巢组织形态学变化;酶联免疫测定法(ELISA)检测大鼠血清性激素水平包括黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)、睾酮(T);ELISA法检测大鼠空腹胰岛素(FINS);即时检测法测定空腹血糖(FPG),并计算出稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);蛋白免疫印迹法(WB)检测大鼠卵巢组织中AKT的蛋白表达量及其相关PTEN的蛋白表达量;实时荧光定量PCR法(q RT-PCR)检测大鼠卵巢组织中miR-106a、PTEN、AKT的表达情况。结果:1.大鼠动情周期:与A组相比,B组动情间期平均天数显著升高(P<0.01);与B组相比,C组动情间期平均天数降低(P<0.05),E组动情间期平均天数显著降低(P<0.01),D组动情间期平均天数变化无统计学意义;C、D、E组之间比较,动情间期平均天数变化无统计学意义。2.大鼠体质量增长率:根据实验前后的体质量变化计算出体质量增长率,与A组相比,B组体质量增长率显著升高(P<0.01),与B组相比,C组、D组、E组体质量增长率显著降低(P<0.01),C、D、E组之间比较,体质量增长率变化无统计学意义。3.HE染色法观察大鼠卵巢组织形态结果示:A组大鼠卵巢内可见多个不同发育阶段的卵泡及较多数目的黄体,颗粒细胞多层,排列较为整齐,呈现出正常卵巢形态;B组大鼠卵巢内出现大量囊状卵泡和直径较大的闭锁卵泡,卵巢发生了多囊样改变,颗粒细胞层数减少,白膜增厚。C组、D组、E组均可见卵巢颗粒细胞增厚,不同发育阶段卵泡增多,有正常卵巢形态趋势。4.Elisa法检测大鼠血清LH、FSH、E2、T含量结果示:与A组相比,B组LH、FSH、T含量均显著升高(P<0.01),E2含量显著降低(P<0.01);与B组相比,C、D、E组LH、FSH、T含量显著降低(P<0.01),E2含量显著升高(P<0.01);与C组相比,D组LH、FSH、T、E2含量均无统计学意义,E组FSH含量显著降低(P<0.01),E组LH、T、E2含量均无统计学意义;与D组相比,E组FSH含量显著降低(P<0.01),E组LH、T、E2含量均无统计学意义。5.血清胰岛素抵抗指数测定:与A组相比,B组血清FPG、FINS含量、以及HOMA-IR值均显著升高(P<0.01);与B组相比,C组、E组FPG、FINS含量、以及HOMA-IR值均显著降低(P<0.01),D组FPG含量降低(P<0.05),FINS含量、以及HOMA-IR值均显著降低(P<0.01);与C组相比,D、E组FPG、FINS含量以及HOMA-IR值均无统计学意义;与D组相比,E组FPG、FINS含量以及HOMA-IR值均无统计学意义。6.WB法检测大鼠卵巢组织中PTEN、AKT蛋白表达量结果示:与A组相比,B组大鼠卵巢中PTEN蛋白表达量显著升高(P<0.01)、AKT蛋白表达量显著降低(P<0.01);与B组相比,C、D、E组大鼠卵巢中PTEN蛋白表达量显著降低(P<0.01)、AKT蛋白表达量显著升高(P<0.01),其中E组大鼠卵巢中AKT蛋白表达量高于C组(P<0.05),显著高于D组(P<0.01)。7.q RT-PCR法检测大鼠卵巢组织中miR-106a、PTEN、AKT m RNA表达水平,结果示:与A组相比,B组大鼠卵巢中miR-106a表达水平显著降低(P<0.01);与B组相比,C、D、E组大鼠卵巢中miR-106a表达水平显著升高(P<0.01),其中E组大鼠卵巢中miR-106a表达水平显著高于C组和D组(P<0.01)。与A组相比,B组大鼠卵巢中PTEN m RNA表达水平显著升高(P<0.01);与B组相比,C、D、E组大鼠卵巢中PTEN m RNA表达水平显著降低(P<0.01);与A组相比,B组大鼠卵巢中AKT m RNA表达水平显著降低(P<0.01);与B组相比,C、D、E组大鼠卵巢中AKT m RNA表达水平显著升高(P<0.01),与C组、D组相比,E组大鼠卵巢中AKT m RNA表达水平均显著升高(P<0.01)。结论:1.针药结合治疗可以降低PCOS-IR模型大鼠的体质量增长率,改善卵巢组织形态学变化,并良性调节血清性激素水平。2.针药结合可以改善PCOS-IR模型大鼠空腹血糖水平以及空腹胰岛素水平,从而改善PCOS-IR模型大鼠胰岛素抵抗指数。3.针药结合可通过调节miR-106a/PTEN/AKT信号通路改善PCOS-IR模型大鼠PCOS-IR症状,提高大鼠卵巢排卵功能,有望成为治疗PCOS-IR的新靶向。
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