【摘 要】
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环己胺氧化酶是催化环己胺生成环己酮的一种胺氧化酶,在环境污染物降解和胺类化合物对映体的手性拆分中得到广泛应用。Acinetobacter sp.YT-02是本实验室筛选到的一株能够以环己胺为唯一碳氮源生长的菌株,前期研究工作异源表达并纯化表征了来源于该菌株的环己胺氧化酶CHAOYT-02,结果表明其活性比CHAOIH-35A高出近162倍,但尚不清楚其催化作用机制。本研究的主要目的是获得环己胺氧化
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环己胺氧化酶是催化环己胺生成环己酮的一种胺氧化酶,在环境污染物降解和胺类化合物对映体的手性拆分中得到广泛应用。Acinetobacter sp.YT-02是本实验室筛选到的一株能够以环己胺为唯一碳氮源生长的菌株,前期研究工作异源表达并纯化表征了来源于该菌株的环己胺氧化酶CHAOYT-02,结果表明其活性比CHAOIH-35A高出近162倍,但尚不清楚其催化作用机制。本研究的主要目的是获得环己胺氧化酶CHAOYT-02的晶体,通过结构生物学的方法解析其晶体结构,确定该蛋白的活性中心,并通过实验验证。为了达到该目的,本研究采用镍柱和分子筛层析纯化该蛋白,获得的蛋白浓度达到6.147±0.087 mg/m L,蛋白纯度超过95%。进一步采用坐滴气相扩散法在试剂盒中初筛晶体,在0.1 M柠檬酸钠（p H5.5）、22%PEG1000条件下获得质量相对较好的晶体,晶体较大但较薄。分别改变p H和PEG1000的浓度对晶体进一步优化,最终在0.1 M柠檬酸钠（p H5.5）、20%PEG1000条件下获得高质量单晶。随后利用X射线-晶体衍射技术,使用第三代同步辐射光源对晶体进行数据采集,得到分辨率为1.49?的衍射数据。经过XDS软件进行数据处理,以CHAOIH-35A为模板,采用分子置换法解析了该蛋白结构。预测底物结合位点氨基酸残基（Leu302、Trp70、Phe197、Phe349和Tyr440）和中间腔位点氨基酸残基（Ile180、Leu181、Ile208和Trp332）为活性中心的氨基酸残基。采用一步克隆技术和重叠延伸PCR技术成功构建了上述九个位点的Ala突变体。进一步表达纯化了突变体Trp70Ala、Ile180Ala、Leu181Ala和Ile208Ala,测定这四个突变体活性,结果显示Trp70Ala与野生型蛋白具有相同的底物谱,但其活性仅相当于野生型的0.01%,表明Trp70参与底物结合,与基于晶体结构解析结果一致;Ile180Ala、Leu181Ala和Ile208Ala对底物环己胺均失去活性,且纯化后的突变体Ile180Ala和Leu181Ala均呈现无色,与可结合FAD的野生型呈现黄色不一致,表明Ile180和Leu181可能参与蛋白与FAD结合。本研究解析了CHAOYT-02的晶体结构,确定了活性中心位点,并构建了活性位点突变体,但仅通过突变体验证了4个活性位点,剩余5个位点有待后续实验进一步验证。为下一步从结构角度阐明CHAOYT-02的催化作用机制奠定了基础,也为CHAOYT-02的定向进化提供理论依据。
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