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目的胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率和致死率都很高。与其他肿瘤相似，编码基因与非编码基因的异常表达参与了胃癌的发生、发展过程。最新研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）与胃癌的关系非常密切，但其作用机制并不完全清楚。因此，获取更多关于miRNA与胃癌发生相关的信息对于揭示胃癌发生的机制具有较为重要的意义。由于miRNA是通过下调靶基因的表达来发挥其生物学作用的，而癌基因的激活是肿瘤发生的重要原因之一，所以，由一些miRNA的低表达所引起的癌基因激活是肿瘤发生的重要原因之一。本课题组在前期研究中发现了7种miRNA明显低表达于胃癌组织中，为此，本研究拟揭示这些miRNA低表达的原因以及它们导致胃癌发生的可能机制。方法1.采用生物信息学方法对7种低表达miRNA的基因启动区序列的CpG岛情况进行分析，筛选出可能受甲基化调控的miRNA。2.使用实时定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测上述筛选出的miRNA在胃癌患者癌组织及对应癌旁组织、胃癌细胞株（MGC-803、AGS和SGC-7901）及正常胃黏膜上皮细胞株（GES-1）中的表达水平，并分别比较其表达水平差异。3.用DNA甲基化酶抑制剂5-杂氮-2’-脱氧胞嘧啶核苷（5-aza-2’-deoxycytidine，5-aza-dC）处理胃癌细胞，了解miRNA表达水平的变化。4.用脂质体分别把miRNA类似物和抑制剂导入胃癌细胞或正常胃黏膜上皮细胞，以提高和降低细胞内相应miRNA的水平。5.使用实时定量RT-PCR技术检测5-aza-dC处理前后或转染类似物与抑制剂前后细胞内相关miRNA水平的变化；使用MTT方法或实时细胞分析（real-timecell analysis，RTCA）技术检测细胞增殖情况；运用流式细胞术检测细胞周期变化；使用蛋白质印迹（Western blot）技术分别检测细胞周期相关蛋白和miRNA相关靶基因表达的变化。6.生物信息学预测和双荧光素酶分析技术验证miRNA的靶基因。结果1.生物信息学分析结果显示，在胃癌组织中低表达的7种miRNA中，有2种miRNA（miR-195和miR-378）的基因启动子区域存在CpG岛。2.实时定量RT-PCR结果显示，MGC-803、AGS和SGC-7901等3种胃癌细胞中miR-195和miR-378的表达水平均明显低于正常胃黏膜上皮细胞GES-1（P<0.001），临床胃癌组织标本中miR-195和miR-378的表达水平也明显低于癌旁组织中的水平（P<0.05）；5-aza-dC处理MGC-803胃癌细胞后，miR-195和miR-378的表达水平明显升高（P<0.05），而另外4种miRNA的表达水平没有显著变化。由于miR-768-3p在最新miRNA数据库（http://www.mirbase.org/cgi-bin/query.pl? terms=miR-768）中不存在了，所以没有对其作进一步的研究。3.5-aza-dC处理胃癌细胞24h或48h后，MGC-803和SGC-7901胃癌细胞的细胞周期被阻止在G2/M或S期；周期蛋白（cyclin）A和周期蛋白依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent protein kinase，CDK）1、CDK2的表达都显著增加了。4.通过转染miRNA类似物分别升高细胞中miR-195和miR-378的水平后，显著抑制胃癌细胞的增殖，却促进正常胃黏膜上皮细胞的增殖；相反，通过转染miRNA抑制剂分别降低细胞中miR-195和miR-378的水平后，显著抑制正常胃黏膜上皮细胞的增殖，而对于胃癌细胞由于其miR-195和miR-378的基础水平本来就低，所以进一步降低这些miRNA并不能促进细胞增殖。5.经升高胃癌细胞中miR-195和miR-378的水平后，胃癌细胞的细胞周期分别被阻止在G0/G1期和G2/M期。6.蛋白质印迹结果显示，肿瘤相关蛋白CDK6和血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）分别为miR-195和miR-378发挥抑癌作用的下游蛋白之一；双荧光素酶分析技术进一步验证了他们之间的这种负向调控关系。结论首先，通过生物信息学分析和DNA甲基化酶抑制剂实验的结合，证实了基因启动子区高甲基化是导致胃癌细胞中miR-195和miR-378低表达的主要原因。其次，经采用miRNA类似物和抑制剂分别增加和降低细胞中miR-195和miR-378的水平，说明了这2种miRNA具有抑癌作用。最后，通过分析它们的相关靶基因，阐明了其抑癌作用的分子机制之一是分别影响到CDK6和VEGF的表达而改变细胞周期进程。