放射治疗是目前恶性肿瘤的常用治疗方法之一。但是放疗的同时也经常引起一系列辐射产生的副作用，对放疗的进一步进行产生很大的影响，故在放射治疗过程中常常会采用局部照射和分割照射法。尽管现代放疗技术和方法都很先进，但是放疗的过程中仍不可避免的会造成正常组织的损伤。皮肤是人体体表的天然屏障，因此，放疗过程中辐射会直接或间接诱发皮肤损伤（即放射性皮炎），据称约95%的患者接受放疗后均会产生放射性皮炎。放疗过程中的局部照射通常会对所照区域皮肤产生一系列的急性辐射损伤现象：红斑、肿胀、水疱、溃疡；随之则会出现坏死、纤维化及水肿等慢性炎症反应。而因头颈部肿瘤接受局部照射的患者则常伴发口腔黏膜腮腺等的损伤，包括口腔干燥、黏膜炎以及吞咽困难，从而导致这些患者大部分有营养不良和体重下降情况。电离辐射主要通过直接作用和间接作用对生物体的造成损伤效应，其中70%-80%左右的辐射损伤由间接作用所引起，而羟自由基在间接作用的损伤中发挥了重要影响。在放疗过程中诸如辐射引起皮肤等正常组织的损伤这些不良的反应大部分都是因电离产生羟自由基所致。近几年过国内外大量的研究发现，氢气能选择性减少羟自由基的细胞毒性。这一生物学效应引起了我们辐射防护科研人员的关注，因为减轻或降低机体组织器官受到辐射引起的伤害，其重要途径就是清除或者抑制辐射中所产生的大部分自由基，达到增强机体的抗辐射能力。目前国内外辐射防护研究的突破口就是而寻找高效、低毒的辐射防护剂，来减轻或降低辐射所导致正常组织及细胞的损伤。现今国内外临床中应用于皮肤等组织辐射防护的方法很多是使用化学合成的药物，细胞因子，或者天然植物提取物等，这类药物普遍防护效价不高，而毒副作用偏大。而近年来本科室用氢气来作辐射防护实验，均取得一系列很好的效果。但是氢气对放射性皮炎的防护作用效果如何还未知晓。近年来有人证明用氢水处理高糖环境下的人皮肤成纤维细胞发现可以通过减少细胞周围环境的氧化应激，从而减少高糖环境对细胞的损伤。我们于是推测富H2溶液对皮肤的辐射防护会有很好的效果。另外，我们将氢气配制成富H2溶液，既解决了氢气使用过程中可能存在的危险性（易燃易爆），又使得氢气更容易被机体所吸收和更易储存，再者，富H2溶液最大的优点还是它基本上无任何毒副作用。本课题研究中成功建立了大鼠头颈部放射性皮炎，并以人皮肤表皮角质细胞和大鼠为对象，探讨富H2溶液对它们的辐射防护效应。研究内容：1.富氢溶液处理人皮肤细胞观察辐射防护效应：选取HaCaT（人正常永生系表皮角质）细胞作为研究对象，予不同照射剂量，建立剂量存活曲线，并在此基础上分别观察：①各组细胞存活率的影响；②各组细胞凋亡情况的影响。2.富氢溶液处理大鼠头颈部皮肤观察辐射防护效应：①大鼠头颈部放射性皮炎模型的建立；②γ射线照后各组大鼠体重的变化；③γ射线照后各组皮肤效应的变化；④γ射线照后各组大鼠皮肤结构的变化。3.富氢溶液辐射防护效应及机制的初步探讨：①分析富氢溶液对γ射线照射后HaCaT细胞氧化应激的影响；②富氢溶液对照后大鼠头颈部皮肤组织中炎症相关因子表达情况的变化；③腹腔注射富氢溶液后，测定大鼠头颈部皮肤中的氢浓度。实验方法：1.制备富氢溶液及富氢培养基：本实验室已成功建立了制备富氢溶液的常规应用方法。并且通过氢电极的检测，已验证富氢溶液中氢气的含量已达到过饱和状态（其中富H2生理盐水，富H2PBS，富H2纯净水，氢气浓度分别为0.809mmol/L；0.814mmol/L；0.823mmol/L）。2.细胞培养： HaCaT细胞为来源于人正常永生化表皮角质细胞系的建株细胞（上海市第九人民医院整形外科细胞库提供）。HaCaT细胞培养条件：10%胎牛血清（美国PAA公司），RMPI-1640培养基（美国PAA公司），温度：37℃，饱和湿气，5%CO2，予中型细胞培养箱中孵育。3.大鼠及细胞γ射线照射：根据实验设计使用钴－60γ射线照射，剂量率调为1.0Gy/min。4.富H2溶液氧化应激的效果：利用SOD、GSH、MDA检测氧化应激。5.细胞存活率测定：采用CCK-8方法检测不同处理组细胞的存活率。6.细胞凋亡分析：利用流式细胞仪检测，检测前用Annexin V/PI双染，得出凋亡百分率的变化。7.腹腔注射富氢溶液后皮肤氢浓度变化：观察不同时间点皮肤中氢浓度变化，利用氢电极在指定时间点检测皮肤中含氢浓度。8.大鼠全身情况：观察照射前予不同处理组大鼠照射后体重等全身情况。9.大鼠皮肤组织结构的变化：观察大鼠皮肤一般情况，用临床评分评测，用HE染色切片观察病理变化。10.炎症相关因子的检测：利用RT-PCR检测各组大鼠头颈部皮肤组织相关因子的表达情况的变化。11.统计方法：采用t检验；方差分析分别比较单组间；多组间，数值以表示， P＜0.05即有统计学差异意义。实验结果：1.富H2溶液处理人正常永生化表皮细胞系HaCaT细胞观察辐射防护作用HaCaT细胞存活率均随照射剂量增加而下降，照射剂量为8Gy时，照前给氢组HaCaT细胞存活率为62%，高于单纯照射组的42.4%。从图中还可以看出，照前5分钟加入富H2溶液，HaCaT细胞的存活率随着照射剂量的增加而依次下降。但照前给氢组细胞存活率都明显高于单纯照射组细胞存活率，有统计学差异（P<0.05），说明HaCaT细胞经富H2溶液处理后产生一定的辐射防护作用。2.富H2溶液处理大鼠头颈部皮肤观察辐射防护作用：2.1放射性皮炎模型的建立：配制10%水合氯醛，根据SD大鼠体重，按照剂量300mg/kg，通过腹腔注射麻醉，将已麻醉的SD大鼠固定于自制的塑料透明容器内，照射区域为头颈部，身体其他部分用铅板遮蔽，于第二军医大学辐照中心予剂量率1Gy/min的伽马射线照射，大鼠腹部面向放射源，按照射剂量分别给予单次或多次分割照射。照射后送回本教研室动物房统一饲养。2.2富H2溶液处理受照大鼠接受不同剂量照射后体重的影响：选用大鼠体重指标作为初步判断不同剂量γ射线照射后富H2溶液对大鼠的影响。照射前5分钟，给药组大鼠腹腔注射5mL/kg富H2生理水（0.6mmol/L），对照组为单纯照射组。15,20,25Gyγ射线单次照射后，连续观察2周内大鼠体重变化情况。结果如Fig.3A，3B和3C所示，富H2溶液对20Gy单次照射效果辐射防护明显，而在15，25Gy单次照射后的防护效果不明显。说明富H2溶液在20Gy照射时减轻电离辐射对口腔黏膜皮肤的防护效果较好。2.3富H2溶液处理受照大鼠接受分割照射后体重的影响：通过模拟临床放射治疗分割照射方法，对大鼠头颈部皮肤采取分割照射。予SD大鼠每天局部照射10Gy，连续三天，总照射剂量为30Gy。照射前5分钟，给药组大鼠腹腔注射5mL/kg富H2生理水（0.6mmol/L），对照组为单纯照射组。连续观察2周内大鼠体重情况，单纯照射组的体重于10天左右下降明显，而富H2溶液组的体重下降相对较轻，体重恢复亦相对较快。说明富H2溶液对分割照射时减轻电离辐射对口腔黏膜皮肤有一定的防护效果。2.4富H2溶液处理受照大鼠皮肤组织及临床改变的影响：通过对照射后大鼠的皮毛连续观察，根据放射性皮炎评分标准作皮炎评分图，可以看出，照射10天左右，单纯照射组大鼠及生理盐水组被照射区域皮肤出现红肿，红斑形成；富氢溶液组皮肤损伤情况较模型组轻；照射15天后，单纯照射组大鼠及生理盐水组被照射区域皮肤出现片状红斑，脱屑及破溃；富氢溶液组皮肤损伤情况较轻，红斑少，破溃较轻；照射20天后，单纯照射组大鼠及生理盐水组大鼠被照射皮肤呈现大面积片状红斑，溃烂以及明显老化；富氢溶液组皮肤损伤情况较轻，红斑少，破溃轻，创面愈合时间明显缩短。通过对照射后15天的皮炎症状比较，在每次分割治疗照射前给予富氢溶液组大鼠头颈部皮炎症状明显轻于照射前给予生理盐水组，说明富H2溶液对分割照射时减轻电离辐射所引起的放射性皮炎有一定的防护效果。2.5富H2溶液处理受照大鼠皮肤组织及舌黏膜组织病理改变的影响：观察HE染色切片可了解皮肤的病理变化。我们发现，予30Gy分割照射后第15天，生理盐水处理组的皮肤组织损伤严重，并可以看到大量炎症细胞浸润，伴有部分毛囊上皮破坏，脱落伴糜烂。而富氢溶液组的皮肤组织的病理切片与空白对照组相比几乎变化不大，其皮损部位偶见毛囊上皮破坏，减少至消失，并可见纤维母细胞、胶原纤维增生。显示富H2溶液对分割照射时电离辐射对大鼠皮肤组织的损伤有一定的防护效果。3.探讨富H2溶液对皮肤组织辐射生物学效应的机理3.1富H2溶液处理受照射的皮肤细胞内观察抗氧化酶超氧化物歧化酶、谷胱甘肽的影响：8Gy照后12h富H2溶液组与单纯照射组HaCaT细胞SOD、GSH活性均有不同程度的下降，但富H2溶液组细胞SOD、GSH活性显著高于单纯照射组。3.2富H2溶液处理受照皮肤细胞内脂质氧化产物丙二醛的影响：8Gy照后12h富H2溶液组与单纯照射组HaCaT细胞中MDA浓度均有升高（程度不同），但富H2溶液组HaCaT细胞MDA浓度显著低于单纯照射组。3.3富H2溶液处理受照大鼠皮肤组织炎症相关因子表达的影响：大鼠20Gy γ射线单次照射24h后，提取大鼠头颈部内的皮肤进行RT-PCR检测，结果显示，与单纯照射组相比，富H2溶液组中的炎症细胞因子IL-1b，TNF-a及IL-6的产生均有减少。3.4氢气在大鼠皮肤组织中的浓度变化：腹腔注射富H2溶液后，分别按照不同时间段用氢电极检测大鼠局部皮肤组织的氢气的浓度变化。结果显示，5min时分子氢在皮肤组织的浓度达到最大，而之后浓度开始下降，在15min左右时回复到基础值。讨论与分析：在临床上，放疗反应所导致的放射性皮肤损伤历来就是影响放疗进展的严重问题，急慢性放射性皮炎也因此成为放疗中要解决的难题。电离辐射主要通过直接作用和间接作用对生物体的造成损伤效应，70%-80%左右的辐射损伤由间接作用所引起，而这也是辐射所致皮肤疾病引发的主要原因。在这一基础上，我们考虑通过清除自由基这一途径，能有效增强机体抵抗辐射的能力，在很大程度上减轻辐射对机体造成的损伤。国内外近年的研究发现氢气具有的能力是能够选择性清除羟自由基。本实验室已经在之前的研究中也明确了富氢溶液能产生良好的辐射防护作用，并无任何毒复作用，且对动物的生殖系统及造血系统有明显的保护作用。本课题研究中观察到富氢溶液能提高照后HaCaT细胞的存活率，并降低HaCaT细胞中因辐射产生的氧化应激，以及降低HaCaT细胞的凋亡率。同时还观察到其对大鼠皮肤及整体亦有良好的辐射防护效应，照前予大鼠腹腔注射富氢溶液能够减缓大鼠的体重下降，减轻大鼠皮肤的损伤。我们也初步研究了富氢溶液的辐射防护机制，并观察到照前给予富氢溶液能减少由于氧化损伤所致的相关炎症因子表达从而减轻正常皮肤损伤程度，并有效降低照后HaCaT细胞的氧化损伤程度。结论：富氢溶液对大鼠头颈部皮肤及人正常永生化表皮角质细胞的辐射损伤具有较好的防护作用，这一效应的产生可能是富氢溶液能清除辐射产生的自由基并减轻氧化损伤有关。氢气早已应用于潜水医学，且被证明对人体并无任何毒复作用，因此我们认为在辐射损伤防护领域里富氢溶液将有很好的开发前景。