糖尿病是目前全球重大的公共卫生挑战之一。过去三十年中，全球糖尿病患者的人数增加了一倍之多。预计在2030年将上升到4.39亿,占世界20-79岁成年人总数的7.7%[1]。近90%2型糖尿病(T2DM)患者的发病可归因于五大生活方式因素：饮食、体力活动、吸烟、肥胖和饮酒[2,3]。同时，空腹血糖或葡萄糖耐量受损通常被认为是T2DM的高危因素[4]。生活方式干预被认为是控制糖耐量受损的超重患者发生T2DM的最有效的手段[5]。近期的meta分析研究已经证实食用全大豆类食品可以显著降低空腹血糖浓度[6]。大豆甙元（daidzein）是大豆异黄酮的主要存在形式之一，其在肠道内经微生物降解后的代谢产物S型雌马酚（S-Equol，S-Eq）具有更高的生物利用度和生物学活性，国内外学者多认为大豆异黄酮的生物学活性主要由Eq来实现[7,8]。硫氧还蛋白相互作用的蛋白（thioredoxin-interacting protein，Txnip），也称为维生素D调节蛋白质（VDUP1）或硫氧还蛋白结合蛋白（TBP2)，其最初被人们发现是由于维生素D对其具有很强的调控作用。最近的研究发现糖尿病发病过程中，高血糖及胰岛素敏感性，葡萄糖摄取，胰岛素刺激的胰岛素分泌和β细胞凋亡的调控可诱导Txnip表达。Lee等实施的人群研究发现Txnip在前驱糖尿病患者和糖尿病患者肌肉组织出现显著的高表达，并且伴随葡萄糖摄取量的下降。Txnip的表达可被多条细胞外葡萄糖调控路径影响[9]。碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrate response element bindingprotein，ChREBP)和Max样蛋白（Max-like protein X, Mlx）是影响Txnip表达的主要转录因子[10,11]。Txnip的高表达可增加糖酵解中间产物的形成，从而引起ChREBP: Mlx复合物结合Txnip启动区域的碳水化合物反应元件，进而影响Txnip启动子活性，增强Txnip的表达[12-14]。目前，Yu等学者发现线粒体氧化磷酸化抑制剂可使糖酵解通量增加和糖酵解中间体减少，从而调控ChREBP和Mlx影响Txnip表达[14]。同时，Chai等证实缺氧条件可导致ChREBP: Mlx复合物的合成减少，从而引起Txnip的表达下降[15]。并且，Txnip缺失可影响改善肌肉、脂肪等外周组织靶细胞胰岛素受体信号转导，促进胰岛素受体底物（insulin receptor substrate, IRS）-1的磷酸化以及葡萄糖转运蛋白-4（Glut-4）的转位，从而增加葡萄糖的吸收、利用，增强外周组织的胰岛素敏感性[23]。而IRS-1是第一个被克隆且最具有特征的胰岛素底物受体蛋白，是胰岛素刺激葡萄糖转运的信号转导途径中重要调控点之一。目前研究证实，胰岛素可通过与靶细胞表面的胰岛素受体结合，激活受体β亚单位的酪氨酸激酶，然后导致一系列IRS-1的酪氨酸磷酸化[16]，磷酸化的IRS-1与细胞内PI3K调节亚基p85的同源区2(SH2)结合，从而激活Glut-4及糖原合成酶的的表达[17,18]。国内外研究多认为S-Eq是SI抗糖尿病的重要因子[8,19]，但其具体作用以及分子靶点尚不清楚。现有对S-Eq生物学作用的认识，如抗氧化、雌激素样作用等并不能很好地解释其防护机制，进一步深入研究S-Eq对糖尿病的影响及其作用分子机制具有重要意义。本研究采用高糖培养人肝癌细胞株HepG2构建胰岛素抵抗模型，经1、10、100μMS-Eq处理细胞后，通过MTT法检测细胞活力、硫酸蒽酮比色法检测胰岛素刺激细胞糖原合成量，以及流式细胞术和激光共聚焦技术观察S-Eq对细胞葡萄糖摄取能力的影响，首先明确S-Eq对HepG2细胞胰岛素敏感性的影响。并在此基础上，采用RealtimePCR和Western blot法进分别检测IRS-1/PI3K/Glut4及ChREBP-Mlx/Txnip mRNA及蛋白表达变化情况，同时通过转染si-ChREBP进一步探讨S-Eq是否通过干扰ChREBP-Mlx调控Txnip蛋白表达，旨在明确S-Eq对HepG2细胞胰岛素敏感性影响的分子机制。主要结果和结论总结如下:1. MTT法检测S-Eq对HepG2细胞活力影响结果显示，1、10、100μM S-Eq和20μM罗格列酮（Rosiglitazone，ROS）处理细胞24h后，细胞活力均未发生显著变化（P>0.05）。提示S-Eq对HepG2细胞活力无明显不良影响。2.硫酸蒽酮法检测细胞糖原合成结果显示，1、10、100μM S-Eq均能够显著增加胰岛素刺激细胞糖原合成量，其中10μM S-Eq+高糖(high-glucose, H)组效果最为显著，接近ROS阳性对照组水平。流式细胞检测技术结果显示，高糖培养HepG2细胞胰岛素刺激葡萄糖摄取量较Control组明显减少，经S-Eq处理后，细胞葡萄糖摄取量显著上升，其中10μM S-Eq+H组胰岛素刺激糖原合成量增加最为显著（P <0.01）。同时，激光共聚焦检测法结果提示，高糖处理导致2-NBDG标记条件下细胞荧光强度明显减弱。经过S-Eq处理后，细胞荧光强度明显增强，其中10、100μM S-Eq作用接近阳性对照组水平。实验结果提示S-Eq能够显著增加胰岛素刺激的细胞糖原合成及葡萄糖摄取，从而改善肝细胞胰岛素敏感性。3. Realtime PCR检测结果显示：H组中IRS-1，PI3K和Glut-4mRNA表达量明显低于Control组。经S-Eq处理12h后，不同浓度S-Eq处理组中IRS-1mRNA表达量均显著上调，PI3K和Glut-4mRNA表达量在10、100μΜ S-Eq+H组中显著增加。Western blot检测结果显示，与Control组相比，H组中IRS-1，PI3K和Glut-4蛋白表达量显著下降，经S-Eq处理24h后，与H组相比，IRS-1，PI3K和Glut-4蛋白表达量呈现显著上升趋势。结果表明，S-Eq可能通过上调IRS-1/PI3K/Glut-4基因表达影响肝细胞糖原合成及葡萄糖摄取。4. Realtime PCR检测结果显示，与Control组比较，H组中Txnip和ChREBP mRNA表达量明显上升，S-Eq处理细胞后，Txnip和ChREBP mRNA表达量呈现明显下降趋势。Western blot检测结果显示，与Control组比较，H组中Txnip，ChREBP和Mlx蛋白表达量显著增加，S-Eq处理24h后，以H组为对照组，Txnip，ChREBP和Mlx蛋白表达量呈现明显下降。转染ChREBP-siRNA细胞后，Western blot结果显示，Txnip和ChREBP蛋白表达被明显抑制，ChREBP-siRNA转染组内，H组中Txnip和ChREBP蛋白表达量明显高于Control组，以H组作为对照组，不同浓度S-Eq+H组中，Txnip和ChREBP蛋白表达量显著下降。Control-siRNA转染组内，与Control组比较，H组中Txnip和ChREBP蛋白表达量均明显上升，经S-Eq处理24h后，Txnip和ChREBP蛋白表达量显著下降。以上研究结果表明，S-Eq抑制ChREBP-Mlx/Txnip的信号通路的传导可能是其改善肝细胞胰岛素敏感性的重要机制之一。以上研究结果提示，ChREBP，Mlx和Txnip在HepG2细胞糖代谢途径中发挥重要作用。S-Eq可能通过调控ChREBP和Mlx表达抑制Txnip信号通路，并通过上调IRS-1，PI3K和Glut-4基因表达改善HepG2细胞糖原合成和葡萄糖摄取能力，从而影响肝细胞对糖的利用。