研究背景冠心病是严重威胁人类健康的一大类疾病,内皮损伤是动脉粥样硬化的始动环节。内皮细胞是覆盖在血管内膜上的单层细胞,是循环血液与血管平滑肌间的机械屏障。内皮细胞可分泌多种血管活性物质,在维持血管舒缩功能、防止血小板黏附和血栓形成以及调节血管平滑肌细胞的生长和增殖等方面发挥重要作用。冠心病相关危险因素可导致内皮细胞损伤、凋亡,破坏血管内皮的完整性,继而引起内膜通透性增加、炎症细胞浸润、平滑肌细胞增生,促进冠心病的发生、发展,因此修复损伤的血管内皮对防治冠心病具有重要意义。内皮修复常需要损伤周边成熟内皮细胞的迁移和增殖,然而成熟内皮细胞增殖能力低,修复受损内皮能力有限。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是内皮细胞的前体细胞,表达干细胞和内皮细胞表面标志,具有高增殖潜能及内皮特性。在生理或病理条件下,EPCs可从骨髓动员至外周血,归巢到血管损伤部位,增殖分化为成熟内皮细胞,促进损伤内皮的修复,同时通过旁分泌作用调节血管舒缩功能。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)是一氧化氮(nitric oxide, NO)合成的关键酶,其催化生成的NO具有扩张血管、调节血管张力、防止血栓形成、防止动脉粥样硬化、抑制平滑肌细胞增殖等生物学功能。新近观点认为eNOS在EPCs的动员、分化及归巢过程中发挥重要作用。多项研究结果发现VEGF、他汀类药物、雌激素、促红细胞生成素等均可通过活化Akt蛋白激酶上调eNOS途径促进EPCs的动员,从而加快损伤内皮的修复,防止内膜过度增生。然而,eNOS基因敲除或使用NOS抑制剂则可阻止上述物质对EPCs的动员作用。利用基因转染技术探讨eNOS对EPCs生物学功能及损伤血管再内皮化的影响具有重要的研究价值。方法1. pMSCV-eNOS的鉴定与扩增通过RT-PCR及测序进行鉴定;通过反复感染293细胞,扩增携带人eNOS基因的重组逆转录病毒载体(pMSCV-eNOS)。2.EPCs分离、培养及鉴定Ficoll密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞,接种于包被纤维连接蛋白的培养板中,在添加了20%胎牛血清, 50ng/mL VEGF, 5ng/mL b-FGF, 10ng/mL EGF的M199培养液中常规培养,倒置显微镜下动态观察细胞生长特性及形态学变化,绘制EPCs生长曲线;通过免疫组化染色鉴定EPCs表面标志eNOS、vWF表达,细胞荧光染色检测EPCs与UEA-I结合及对乙酰化低密度脂蛋白(acLDL)摄取特性,测定细胞培养液中NO含量,检测EPCs分泌NO能力。3.pMSCV-eNOS转染对EPCs增殖、黏附、迁移的影响及NO及VEGF的分泌通过病毒感染构建eNOS过表达的EPCs细胞模型,通过绿色荧光蛋白(GFP)的表达,检测感染效率。用RT-PCR、Western-blot检测受感染EPCs内eNOS的mRNA和蛋白表达,检测通过逆转录病毒感染能否有效引起EPCs内eNOS的过表达。采用四氮唑溴盐比色(MTT)法、改良的Boyden小室和黏附能力测定来观察pMSCV-eNOS转染对EPCs增殖、迁移和黏附能力的影响。通过硝酸还原酶法及ELISA法测定EPCs培养液中NO及VEGF含量。4.pMSCV-eNOS转染EPCs对内皮细胞及平滑肌细胞增殖、迁移的作用培养大鼠血管平滑肌细胞和内皮细胞,将eNOS基因修饰EPCs接种于下室,分别将平滑肌细胞、内皮细胞接种于上室,建立细胞共培养体系,通过MTT法及细胞周期测定分析eNOS基因修饰EPCs对内皮细胞和平滑肌细胞的增殖作用,用迁移计数方法观察eNOS基因修饰EPCs对内皮细胞及平滑肌细胞迁移的影响。5.转染eNOS基因的EPCs移植在血管内膜修复中的作用建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,将转染eNOS基因的EPCs通过尾静脉移植至大鼠体内。损伤后14d取目标血管,通过RT-PCR、Western Blot方法进行检测损伤血管局部eNOS的表达情况;行HE染色、伊文氏蓝染色计算内膜/中膜面积比及损伤血管再内皮化比例,观察eNOS基因修饰EPCs移植对损伤血管新生内膜的影响。利用逆转录病毒载体中含用绿色荧光蛋白对EPCs示踪,观察移植EPCs是否能归巢至血管损伤局部。测定Ach诱导的内皮依赖性血管舒张功能,了解pMSCV-eNOS转染的EPCs归巢至血管损伤局部对血管舒张功能的调节作用。结果1.鉴定已构建好的pMSCV-eNOS,通过感染293细胞,携带人eNOS基因的重组逆转录病毒载体(pMSCV-eNOS)得到扩增,获得较高滴度的病毒液。2.EPCs培养鉴定细胞培养3-5 d可以观察到细胞增多增大并伸展呈纺锤形或短梭形细胞,有少量细胞突起。培养7-10 d,梭形细胞较前明显增多,并呈簇状生长,表现为中心为圆形细胞,边缘出芽长出的梭形细胞呈放射状分布,形成细胞克隆。14d可看到细胞首尾相连,具有成索状或网状血管样趋势。培养20天后,细胞相互融合呈铺路石状。体外分离诱导培养的大鼠骨髓EPCs,经免疫组化染色鉴定表达内皮细胞表面标志eNOS、vWF,具有结合UEA-I及摄取acLDL能力,并能分泌NO,具有成熟血管内皮细胞的部分特征。3.pMSCV-eNOS转染对EPCs部分生物学功能的影响(1) EPCs转染效率及转染后eNOS mRNA和蛋白表达逆转录病毒对EPCs转染率达92%。pMSCV-eNOS转染EPCs后72h ,RT-PCR和Western blot检测显示细胞内有eNOS的mRNA和蛋白表达,NOS抑制剂L-NAME可抑制eNOS表达。(2) pMSCV-eNOS转染对EPCs增殖能力的影响MTT分析提示pMSCV-eNOS转染EPCs可增加EPCs的增殖能力(pMSCV-eNOS转染组vs未转染组,0.582±0.014 vs 0.357±0.009,P<0.01),未转染组及pMSCV-GFP转染组之间EPCs的增殖能力无显著性差异(pMSCV-GFP转染组vs未转染组,0.365±0.009 vs 0.357±0.009 , P>0.05)。NOS抑制剂L-NAME可降低转染后EPCs的增殖能力(pMSCV-eNOS转染组vsL-NAME干预组,0.582±0.014 vs 0.46±0.009,P<0.01)。(3) pMSCV-eNOS转染对EPCs迁移功能的影响pMSCV-eNOS转染组可增加EPCs的迁移能力(pMSCV-eNOS转染组vs未转染组,20.50±1.87 vs 12.17±0.75,P<0.01),pMSCV-GFP转染组与未转染组之间EPCs的增殖能力无显著性差异(pMSCV-GFP转染组vs未转染组,12.33±1.03 vs 12.17±0.75,P>0.05),而L-NAME可显著降低转染后EPCs的迁移能力(pMSCV-eNOS转染组vsL-NAME干预组,20.50±1.87 vs 15.50±1.05,P<0.01)。(4) pMSCV-eNOS转染对EPCs黏附功能的影响pMSCV-eNOS转染后EPCs黏附能力增强(pMSCV-eNOS转染组vs未转染组,42.00±1.41 vs 30.67±0.82,P<0.01);pMSCV-GFP转染组与未转染组间无显著性差异(30.67±0.82 vs 30.00±1.41 , P>0.05) , L-NAME可降低转染后EPCs的黏附能力(pMSCV-eNOS转染组vsL-NAME转染组,42.00±1.41 vs 34.83±1.17,P<0.01)。(5) pMSCV-eNOS转染对EPCs分泌NO的影响eNOS基因转染可显著促进EPCs NO的分泌(pMSCV-eNOS转染组vs未转染组,68.32±1.46 vs 35.13±1.28,P<0.01),而抑制剂L-NAME可降低转染后EPCs NO的分泌(pMSCV-eNOS转染组vs L-NAME干预组,68.32±1.46 vs 46.06±2.37,P<0.01)。(6)转染pMSCV-eNOS对EPCs分泌VEGF的影响pMSCV-eNOS转染EPCs可明显促进EPCs分泌VEGF(pMSCV-eNOS转染组vs未转染组,203.47±16.26 vs 153.71±14.17,P<0.01),pMSCV-GFP转染组与未转染组之间无显著性差异(156.32±1070 vs 153.71±14.17,P>0.05),L-NAME则抑制了转染EPCs分泌VEGF的作用(203.47±16.26 vs 174.96±14.50,P<0.01)。4.pMSCV-eNOS转染EPCs对内皮细胞及平滑肌细胞增殖、迁移的作用pMSCV-eNOS转染EPCs可促进ECs的增殖(eNOS转染组vs对照组,0.482±0.009 vs 0.361±0.009,P<0.01)、迁移(eNOS转染组vs对照组,17±1 vs 11±1,P<0.01),促进ECs进入S期(eNOS转染组vs对照组, 62.3±2.32 vs 43.9±1.21 , P<0.01) ;pMSCV-eNOS转染EPCs可抑制SMCs的增殖(eNOS转染组vs对照组,0.247±0.006 vs 0.350±0.004,P<0.01)、迁移(eNOS转染组vs对照组,11±1 vs 26±1,P<0.01),增加SMC停留在G1期的比例,抑制SMCs进入S期(eNOS转染组vs对照组,8.61±0.74 vs 15.08±1.96,P<0.01)。5.转染eNOS基因的EPCs移植在血管内膜修复中的作用成功建立了大鼠颈动脉损伤模型,损伤后经尾静脉将转染eNOS基因的EPCs通移植至大鼠体内。损伤后14d取目标血管,RT-PCR、Western Blot方法检测损伤血管局部eNOS的mRNA及蛋白表达明显增加,免疫组化表明eNOS-EPCs移植组损伤血管段eNOS表达明显增强。荧光显微镜观察发现在血管损伤局部存在GFP示踪的EPCs。HE染色观察发现EPCs移植可明显抑制新生内膜的过度增殖,而eNOS过表达可进一步加强这种抗增殖效应。Even’s blue染色提示EPCs移植可加速损伤血管处再内皮化过程,eNOS基因修饰的再内皮化作用则更加明显,再内皮化面积>50%。对Ach诱导的内皮依赖性血管舒张功能测定后发现,EPCs移植可改善内皮依赖性血管舒张反应。eNOS基因修饰的EPCs可进一步加强这种效应。结论1.逆转录病毒可以安全、有效的转染EPCs,转染率达90%以上。pMSCV-eNOS转染EPCs后72h ,RT-PCR和Western blot检测显示细胞内有eNOS的mRNA和蛋白表达,NOS抑制剂L-NAME可抑制eNOS表达,pMSCV-eNOS转染可明显促进EPCs的增殖、迁移、黏附功能,增加EPCs分泌NO、VEGF能力;2. pMSCV-eNOS转染EPCs可促进EC的增殖、迁移能力,抑制SMC的增殖、迁移能力;3.eNOS基因修饰EPCs移植可归巢至血管损伤局部,抑制新生内膜的过度增生,加速损伤内皮的再内皮化,明显改善内皮依赖性血管舒张反应。