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双调蛋白是重要的局部调控因子,在卵巢颗粒细胞与滋养层细胞高表达,是LH/hCG峰后卵泡液及早孕期羊水中表达量最高的表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）家族因子。既往研究显示,双调蛋白介导着LH/hCG的促卵丘复合体扩张、卵子成熟和颗粒细胞内孕激素合成的作用,并且双调蛋白上调合体滋养层细胞hCG的表达及分泌。关于双调蛋白在女性生殖系统调控作用的研究尚不完善,本研究从以下三个部分研究双调蛋白对黄素化颗粒细胞激素生成和滋养层细胞浸润的调控作用:1.双调蛋白对人黄素化颗粒细胞内芳香化酶表达和雌激素合成的调控作用及机制;2.双调蛋白对人黄素化颗粒细胞内VEGF表达的调控作用;3.双调蛋白对人滋养层细胞浸润的调控作用及机制。第一部分 双调蛋白上调人黄素化颗粒细胞内芳香化酶表达和雌激素生成的机制研究目的研究双调蛋白是否调控人黄素化颗粒细胞内芳香化酶表达及其下游雌激素生成。方法收集行辅助生殖技术助孕治疗女性的颗粒细胞进行原代体外培养,研究双调蛋白对雌激素生成的调控作用和机制。小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）特异性敲低双调蛋白、StAR、EGFR和LHR mRNA的内源性表达,RT-qPCR方法检测mRNA水平,Western-blot方法检测蛋白水平。收集血清、卵泡液和颗粒细胞培养液,ELISA方法检测双调蛋白和雌激素浓度,并进行相关性分析。结果双调蛋白通过活化AKT信号通路上调颗粒细胞内芳香化酶mRNA及其下游雌激素生成。使用EGF受体（EGF receptor,EGFR）抑制剂和EGFR siRNA阻断EGFR通路,LH/hCG对芳香化酶表达和雌激素生成的上调作用也被阻断。相关性分析显示,卵泡液内双调蛋白浓度与卵泡液雌激素浓度、取卵术后第2天血清雌激素浓度显著正相关。结论双调蛋白通过与人颗粒细胞表面EGFR结合活化细胞内AKT信号通路上调芳香化酶mRNA和蛋白水平,促进其下游雌激素合成;双调蛋白介导着LH/hCG的促雌激素生成作用。第二部分 双调蛋白上调人黄素化颗粒细胞内VEGF表达目的研究双调蛋白对人颗粒细胞内血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）的调控作用。方法收集行辅助生殖技术助孕治疗女性的颗粒细胞进行原代体外培养,研究双调蛋白对VEGF生成的调控作用。siRNA特异性敲低双调蛋白和EGFR mRNA的内源性表达,RT-qPCR方法检测mRNA水平。收集卵泡液和培养液,ELISA方法检测双调蛋白和VEGF浓度,并与卵巢过度刺激综合征（Ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS）发生的危险预测因子进行相关性分析。结果双调蛋白可显著上调颗粒细胞VEGF mRNA表达,卵泡液内双调蛋白浓度与卵泡液VEGF浓度正相关。SiRNA敲低双调蛋白和EGFR的内源性表达可阻断hCG对颗粒细胞内VEGF mRNA和蛋白的上调作用。hCG对OHSS患者颗粒细胞内双调蛋白和VEGF mRNA的上调作用显著于正常对照组。OHSS组颗粒细胞内双调蛋白、VEGF、EGFR和ErbB2 mRNA表达水平和卵泡液内双调蛋白、VEGF浓度均高于正常对照组。卵泡液内双调蛋白浓度与OHSS发生的危险因子如基础窦卵泡数（AFC）、获得卵子数、MII卵子数和hCG日、取卵（oocyte pick-up,OPU）日、OPU术后2天血清雌激素水平存在正相关关系。结论双调蛋白介导着hCG对人黄素化颗粒细胞内VEGF表达的上调作用。第三部分 双调蛋白上调滋养层细胞MMP9活性增加细胞浸润目的探究双调蛋白是否参与调控滋养层细胞浸润及其中的机制。方法使用人永生化滋养层细胞系HTR-8/SVneo细胞进行实验,研究双调蛋白对滋养层细胞浸润活动的调控作用。siRNA特异性敲低相应因子的表达,化学性抑制剂阻断相应信号通路,RT-qPCR和western-blot的方法检测相应mRNA和蛋白表达情况。MTT实验检测细胞活性,Matrigel实验评价细胞浸润活动,明胶酶谱实验检测基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）活性。结果双调蛋白可显著上调MMP9和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases-1,TIMP-1）mRNA 表达水平,且对MMP9 mRNA的上调幅度显著于TIMP-1 mRNA。双调蛋白增加HTR-8/SVneo细胞浸润。EGFR、AKT和ERK1/2信号通路抑制剂特异性阻断通路后,HTR-8/SVneo细胞浸润活动显著减弱。ERK1/2和AKT信号通路介导双调蛋白上调的MMP9 mRNA表达和酶活性。AKT信号通路介导双调蛋白上调的TIMP-1 mRNA表达。结论双调蛋白通过激活ERK1/2和AKT信号通路上调MMP9活性增加HTR-8/SVneo细胞浸润。