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果实的色泽是果实品质的重要组成部分，而果皮中的黄酮类物质，尤其是花青苷，对果实的色泽形成起重要作用。光照是影响果皮中黄酮类物质合成的重要环境因素。到目前为止，光照对红梨花青苷合成的调控已有深入的研究，而同属苯丙烷代谢产物的黄酮醇在梨果实中的研究仍较少。在苹果、番茄等园艺作物中的研究表明黄酮醇代谢对果实的色泽形成有重要影响。现有的研究发现SG7亚族的R2R3型MYB转录因子可以促进黄酮醇的合成，且光照对这类基因的表达有显著促进作用。前人的研究发现HY5作为光信号传递的核心转录因子，对类黄酮合成相关的MYB转录因子及结构基因的表达具有重要的调控作用。目前已有一些研究发现HY5既可以转录激活下游基因，也可以抑制某些基因的表达，这其中的调控机制仍然不是很清楚。因此，进一步明确HY5介导光照对类黄酮合成的调控模式具有重要的研究意义。本研究以光敏感型红梨品种‘红早酥’梨为试验材料，探究了与光照相关的转录因子PpMYB96及PpHY5调控类黄酮代谢的分子机制，主要研究成果如下：
1.梨转录因子PpMYB96的功能解析
参考实验室前期对‘美人酥’梨进行套袋后摘袋处理的转录组测序结果，从中鉴定出了一个响应光照的MYB家族基因PpMYB96（Pbr030848.1）。与转录组检测的表达模式类似，蓝光照射可以显著诱导PpMYB96的表达，而在黑暗对照中PpMYB96基因几乎没有表达。分析PpMYB96转录因子的保守结构域发现其属于R2R3型MYB转录因子的第7亚族。通过双荧光素酶试验发现PpMYB96可以转录激活黄酮醇合成相关结构基因的启动子。酵母双杂交试验表明PpMYB96可与PpbHLH33互作，而不能与PpbHLH3互作。但双荧光素酶试验结果显示PpbHLH33仅能增强PpMYB96对PpCHS启动子的转录激活作用，这说明PpbHLH3和PpbHLH33不参与促进PpMYB96对黄酮醇合成相关结构基因的调控。此外，通过同源转化获得了过表达PpMYB96的茄梨愈伤组织，且过表达PpMYB96在促进黄酮醇合成相关结构基因的表达的同时显著抑制了花青苷合成酶基因PpANS的表达。为了后续进一步探究PpMYB96的调控模式，我们发现了蓝光可通过PpHY5正调控PpMYB96的表达，同时通过双分子荧光互补试验发现梨E3泛素连接酶MIEL1可与PpMYB96互作，表明MIEL1可能通过泛素化途径降解PpMYB96来抑制黄酮醇的合成。
2.梨转录因子PpHY5互作蛋白的鉴定及功能探究
以PpHY5为诱饵蛋白，通过酵母双杂交文库质粒筛选试验，鉴定出了一系列可与PpHY5互作的蛋白，其中包括多梳蛋白复合体成员PpLHP1。基于酵母双杂交筛库的结果，我们从梨基因组中鉴定出了两个LHP1基因，分别命名为PpLHP1a及PpLHP1b。同时利用多种生化试验方法证实了PpHY5可与PpLHP1a、PpLHP1b互作。进一步，通过蛋白互作试验发现PpLHP1a、PpLHP1b与PpMYB10也存在互作。分析PpLHP1b蛋白序列发现其包含两个保守的结构域，分别为CD结构域和CSD结构域。将包含不同结构域的蛋白进行分段互作试验发现，CSD结构域是PpLHP1b与PpHY5及PpMYB10结合所必需的。同时，我们以拟南芥多梳蛋白复合体2（PRC2）为参照，鉴定了‘红早酥’梨中PRC2蛋白PpEMF2，PpSWN及PpCLF，蛋白互作分析发现仅有PpCLF能与PpLHP1b结合，说明在梨果实中PpCLF可与PpLHP1b共同参与表观遗传修饰。通过检测蓝光处理‘红早酥’梨过程中PpLHP1b、PpCLF的相对表达水平，发现蓝光可以在一定程度上诱导PpLHP1b、PpCLF的表达。此外，光照处理拟南芥clf-29突变体的结果表明AtCLF可以抑制花青苷的合成，这为我们后续探究其同源蛋白PpCLF的功能提供了表型证据。
综上所述，本研究鉴定了一个响应光照的R2R3型MYB转录因子PpMYB96，可以单独促进黄酮醇合成相关结构基因的表达，并利用过表达PpMYB96的梨愈伤组织验证了其功能。在此基础上我们还鉴定了梨E3泛素连接酶PpMIEL1可与PpMYB96互作，为后续研究PpMYB96的调控模式奠定了基础。此外，我们发现与花青苷合成密切相关的转录因子PpHY5、PpMYB10可与多梳蛋白PpLHP1b、PpCLF结合，由此可以推测PpHY5、PpMYB10可能介导PRC复合体对下游基因启动子进行H3K27me3修饰来调控基因的表达，进而调控花青苷的合成。本文初步探究了与光照相关的转录因子PpMYB96、PpHY5对类黄酮代谢调控的分子机制，为进一步明确光照对类黄酮合成的调控提供了新的思路。
1.梨转录因子PpMYB96的功能解析
参考实验室前期对‘美人酥’梨进行套袋后摘袋处理的转录组测序结果，从中鉴定出了一个响应光照的MYB家族基因PpMYB96（Pbr030848.1）。与转录组检测的表达模式类似，蓝光照射可以显著诱导PpMYB96的表达，而在黑暗对照中PpMYB96基因几乎没有表达。分析PpMYB96转录因子的保守结构域发现其属于R2R3型MYB转录因子的第7亚族。通过双荧光素酶试验发现PpMYB96可以转录激活黄酮醇合成相关结构基因的启动子。酵母双杂交试验表明PpMYB96可与PpbHLH33互作，而不能与PpbHLH3互作。但双荧光素酶试验结果显示PpbHLH33仅能增强PpMYB96对PpCHS启动子的转录激活作用，这说明PpbHLH3和PpbHLH33不参与促进PpMYB96对黄酮醇合成相关结构基因的调控。此外，通过同源转化获得了过表达PpMYB96的茄梨愈伤组织，且过表达PpMYB96在促进黄酮醇合成相关结构基因的表达的同时显著抑制了花青苷合成酶基因PpANS的表达。为了后续进一步探究PpMYB96的调控模式，我们发现了蓝光可通过PpHY5正调控PpMYB96的表达，同时通过双分子荧光互补试验发现梨E3泛素连接酶MIEL1可与PpMYB96互作，表明MIEL1可能通过泛素化途径降解PpMYB96来抑制黄酮醇的合成。
2.梨转录因子PpHY5互作蛋白的鉴定及功能探究
以PpHY5为诱饵蛋白，通过酵母双杂交文库质粒筛选试验，鉴定出了一系列可与PpHY5互作的蛋白，其中包括多梳蛋白复合体成员PpLHP1。基于酵母双杂交筛库的结果，我们从梨基因组中鉴定出了两个LHP1基因，分别命名为PpLHP1a及PpLHP1b。同时利用多种生化试验方法证实了PpHY5可与PpLHP1a、PpLHP1b互作。进一步，通过蛋白互作试验发现PpLHP1a、PpLHP1b与PpMYB10也存在互作。分析PpLHP1b蛋白序列发现其包含两个保守的结构域，分别为CD结构域和CSD结构域。将包含不同结构域的蛋白进行分段互作试验发现，CSD结构域是PpLHP1b与PpHY5及PpMYB10结合所必需的。同时，我们以拟南芥多梳蛋白复合体2（PRC2）为参照，鉴定了‘红早酥’梨中PRC2蛋白PpEMF2，PpSWN及PpCLF，蛋白互作分析发现仅有PpCLF能与PpLHP1b结合，说明在梨果实中PpCLF可与PpLHP1b共同参与表观遗传修饰。通过检测蓝光处理‘红早酥’梨过程中PpLHP1b、PpCLF的相对表达水平，发现蓝光可以在一定程度上诱导PpLHP1b、PpCLF的表达。此外，光照处理拟南芥clf-29突变体的结果表明AtCLF可以抑制花青苷的合成，这为我们后续探究其同源蛋白PpCLF的功能提供了表型证据。
综上所述，本研究鉴定了一个响应光照的R2R3型MYB转录因子PpMYB96，可以单独促进黄酮醇合成相关结构基因的表达，并利用过表达PpMYB96的梨愈伤组织验证了其功能。在此基础上我们还鉴定了梨E3泛素连接酶PpMIEL1可与PpMYB96互作，为后续研究PpMYB96的调控模式奠定了基础。此外，我们发现与花青苷合成密切相关的转录因子PpHY5、PpMYB10可与多梳蛋白PpLHP1b、PpCLF结合，由此可以推测PpHY5、PpMYB10可能介导PRC复合体对下游基因启动子进行H3K27me3修饰来调控基因的表达，进而调控花青苷的合成。本文初步探究了与光照相关的转录因子PpMYB96、PpHY5对类黄酮代谢调控的分子机制，为进一步明确光照对类黄酮合成的调控提供了新的思路。