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双光子荧光显微成像技术是生物成像领域最重要的发明之一，利用该技术可以对生物样品进行非侵入性研究，在三维空间内获得亚微米的成像分辨率。荧光的产生需要同时吸收两个入射光子，这种非线性效应使得双光子显微成像具有高分辨率、高对比度和光漂白只发生在焦点附近区域等优点。另外，使用近红外的飞秒激光作为激励光源，双光子荧光显微成像技术不仅可以减少对生物样品的光损伤，还可以获得超过1000μm的成像深度，这也是该技术与共聚焦荧光显微成像技术相比最主要的优势。本文利用实验室飞秒掺钛蓝宝石激光器作为光源，在现有条件下搭建了一套双光子荧光显微成像系统，并利用该系统开展了双光子显微成像研究。理论上分析了双光子激励产生荧光的过程，利用公式推导证实了飞秒激光用于双光子激励的优势，计算结果表明当平均功率相同时，超短脉冲锁模激光器作用下双光子荧光的产率是连续光输出激光器的105倍；讨论了双光子显微成像技术中的饱和功率以及成像深度问题，得到了饱和激励功率的表达式，并指出减小激光器输出脉宽和重频可以有效提高双光子显微成像技术的穿透深度；利用菲涅耳衍射理论以及Richards和Wolf提出的高数值孔径系统的衍射理论计算出双光子荧光显微成像技术的分辨率应为亚微米量级。实验上，首先完成了双光子显微成像探测器PMT高压供电电源制作，并利用该电源测量了R3896型PMT的暗噪声，结果显示当PMT供电电压超过500V时，暗噪声显著增大；利用PIN型光电二极管研制了一套激光能量诊断装置，该装置可以实时监测入射激光能量的抖动；自行编写了扫描控制软件，并利用该软件和现有硬件搭建了一套双光子显微成像系统，该系统中针对飞秒激光器受环境影响易出现失锁及功率抖动现象，提出利用光纤光谱仪和自制的能量诊断装置实时监测激光器输出。然后测量了不同浓度Rhodamine B溶液的单光子和双光子荧光光谱，发现Rhodamine B溶液的双光子荧光光谱随着浓度的增加，中心波长逐渐向其最大荧光发射波长610nm处靠近，半高宽逐渐增大；当浓度较低时，RhodamineB溶液的单光子和双光子荧光光谱形状基本一致。最后将搭建好的双光子荧光显微成像系统应用到Rhodamine B样品的显微成像和双光子激发光漂白特性研究，证实了显微镜的成像能力和微米级别的分辨能力，并发现双光子激励下Rhodamine B样品光漂白速率与入射激光功率的高次方（>3）成正比。