新霉素是一类具有广谱抗菌性的氨基糖苷类抗生素,在医药与农业等领域应用广泛,具有极高的经济效益。本实验室在前期的工作中发现,在新霉素的生物合成途径中,结构基因neo N、neo E对费氏链霉菌产新霉素具有重要影响。其中neo N编码的酶NeoN催化新霉素生物合成最后一步由新霉素C生成高效低毒、具有更高经济价值的新霉素B。neo E编码的Neo E是合成新霉素母环2-DOS过程中的含锌脱氢酶,它的原位过表达使得新霉素效价得到较大提升。目前NeoN和Neo E均未得到表征。基于NeoN的重要意义,本研究主要通过生物信息学和分子生物学手段探究NeoN的性质、序列和结构特点,并对其催化作用中的关键位点进行了分析和改造。同时也对Neo E的序列、结构进行了初步探究。主要研究内容概括如下:（1）NeoN的氨基酸序列分析利用在线软件分析了NeoN的氨基酸序列,结果显示NeoN是一个稳定的亲水胞内蛋白,生物信息学分析结果显示其属于自由基依赖的S-腺苷-L-蛋氨酸（S-Adenosy-L-methionine,SAM）酶超家族,拥有该家族保守序列Cxxx Cxx C,第26～33位氨基酸是形成铁硫簇并与SAM结合的位点。（2）NeoN的三维结构建模与分子对接由于在对NeoN氨基酸序列进行同源建模时发现其蛋白数据库中现存模板序列同源性较低,因此本研究采用Alpha Fold计算得到的NeoN三维结构。由于NeoN的催化反应依赖SAM,故整个分子对接工作分为两步:一是将SAM分子与NeoN蛋白对接后得到NeoN-SAM复合体结构,比较SAM分子进入前后NeoN构象的变化;二是将新霉素C分子与已得到的NeoN-SAM复合体结构进行对接,分析关键作用位点。将NeoN与NeoN-SAM复合体结构进行重叠比对后发现SAM的结合促使NeoN的底物结合口袋发生诱导契合作用,其中NeoN中三个区域发生了明显的结构变化（L174～F177、E278～S282、D226～N230处）,原本的β片层向外翻折,loop区增加;且口袋内由原本的酸性环境变为更有利于反应的中性环境。该变化可能增大了催化口袋的内部空间,以便新霉素C分子的进入和反应。新霉素C与NeoN的结合主要依赖氢键与盐桥等作用力,Thr38、Gly24、Asp68、Asp23、Gln236、Arg243、Asp248、Tyr250可与底物形成氢键作用。其中Asp68贡献了三个氢键和一个盐桥、Thr38则能与底物分子形成三个氢键。对接结果还显示NeoN的催化口袋十分狭窄,Glu34,Lys36,Ser251,Val252四个位于结合口袋入口处的氨基酸造成了蛋白表面隆起,可能阻碍了新霉素C分子的进入与反应。（3）优化NeoN异源表达条件对NeoN异源表达条件进行优化,成功构建了用于表达目的蛋白的质粒p ET-28a（+）-NeoN和菌株BL21-p N,在铁硫源半胱氨酸和亚铁盐存在的条件下,在添加诱导剂IPTG浓度为0.4 mmol/L,诱导时间18 h,诱导温度为28℃,起始OD600值0.6时,目的蛋白在破碎细胞上清中达到了最大表达量。（4）定点突变与结果分析根据前期对接分析结果,对Thr38、Asp68、Glu34,Lys36,Ser251,Val252进行定点突变。实验结果显示,突变酶NeoN D68A、NeoN T38A的酶活分别下降了27.2%和60.4%,通过软件分析发现38位的苏氨酸和68位的天冬氨酸突变为丙氨酸后,二者的疏水性均有明显增加;对接分析结果显示突变位点处原本的氢键作用力和盐桥作用力消失;为增大催化口袋而构建的突变体NeoNE34A、NeoNK36A,NeoNS251A,NeoNV252A中,NeoNK36A的催化口袋表面积增加了128（?）~2,NeoNV252A的催化口袋体积增加了51（?）~3,NeoNS251A催化口袋的体积和表面积均明显增加;对酶活进行测定,突变体NeoNE34A未检测到活性,NeoNK36A、NeoNS251A、NeoNV252A的酶活分别为突变前的87.5%、66.9%、104.2%。（5）对neo E过表达菌株SF-neo E的相关基因进行转录分析,发现48 h时neo E的转录水平较含有空载质粒的菌株SF-p PR显著上调2.1倍,且调控基因neo H在不同时间段均有小幅度上调。（6）生物信息学分析结果显示Neo E是一个稳定的疏水蛋白,拥有由一个丙氨酸和一个精氨酸形成磷酸盐的结合口袋。其氨基酸序列24～129 aa处为酒精脱氢酶（ADH）的N端催化结构域;171～298 aa处为用于结合辅酶NAD（P）+的Rossnman折叠结构域;168～173 aa处存在Gx Gxx G高度保守结构,为NAD（P）+的结合位点。