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糖复合物(含糖蛋白,糖脂和蛋白聚糖)是继蛋白质和核酸研究的另一新兴领域,其中糖蛋白的结构和功能研究较为活跃。糖蛋白的聚糖部分在细胞黏附,分子运输和清除,受体激活,信号转导等过程中发挥重要作用。聚糖结构变化与许多生理和病理过程相关,比如恶性肿瘤的发生和转移。目前,聚糖结构变化与疾病关系的研究已引起相当重视,如甲胎蛋白N-聚糖核心岩藻糖(AFP-L3)的变化已成为检测肝癌的重要聚糖标志(glyco-biomarker)等。国际上糖蛋白N-聚糖的研究有较大的进展,对聚糖的整体识别和推测有一定的认识,但仍处于起步阶段,对多位点N—糖基化的聚糖结构的分析缺乏具体聚糖的结构解析,缺少对聚糖的宏观不均一性(糖基化位点占有率)和微观不均一性(聚糖结构)的研究。结合珠蛋白(Hp)是一种酸性糖蛋白,广泛存在于人类和许多哺乳动物的血清及其他体液中,其β亚基含有四个糖基化位点,已发现在癌症(如乳腺癌,胰腺癌等)发展过程中其聚糖结构产生变化。本研究建立了抗体亲和层析纯化血清结合珠蛋白β亚基的标准方法,发明了’iTRAQ plus18O’技术,利用高精度串级质量分析仪(MALDI-QIT-TOF MS)和高分辨串联多级质谱系统(LTQOrbitrapXLETD),联合凝集素亲和印迹,对正常人(N)及肝病患者(肝炎HBV,肝硬化LC,肝癌HCC)血清中Hp-β聚糖的宏观和微观不均一性进行研究,确认其作为聚糖分子标志物用于肝病诊断的可能性。第一部分肝病中血清Hp-β的糖基化位点占有率变化本部分研究旨在建立适用于多样本,稳定快速的高通量糖基化位点占有率分析的方法,并以此为基础,分析正常人及肝病患者(HBV, LC, HCC)血清样本中Hp-β四个糖基化位点占有率的变化,为目标糖蛋白宏观不均一性的研究提供技术手段。纯化正常,肝炎,肝硬化,肝癌血清Hp-β，Trypsin酶解后得到的肽段中包括非糖肽和糖肽。三条糖肽分别为NLFLN207HSEN211ATAK MVSHHN184LTTGATLINEQWLLTTAK和VVLHPN241YSQVDIGLIK。本研究自行研发和应用’iTRAQ plus18O’技术,采用iTRAQ和18O两种标记方法,即iTRAQ标记非糖肽和糖肽,18O标记糖肽上的糖基化位点,将串联四极杆飞行时间质谱仪(Qstar XL)的母离子检测窗口扩大至4Da,同时定量分析Hp-β蛋白和糖肽表达水平。某条糖肽的丰度值除以蛋白丰度值得到该糖肽上的糖基化位点占有率,该方法可同时完成四种样品中目标糖蛋白的糖基化位点占有率的计算。经ProteinPilotTM Software (Version3.0, Applied Biosystems)分析, Qstar XL质谱鉴定到Hp-β的13条非糖肽(95%可信度),将其丰度值的平均值作为Hp-p的蛋白水平,得到正常,肝炎,肝硬化,肝癌血清中Hp-β蛋白表达比例为6.43：2.28：1：2.84,表明其蛋白含量在肝病的进程中,呈先降低、再升高的趋势。糖肽NLFLN207HSEN211ATAK在正常,肝炎,肝硬化,肝癌血清中的含量比例是7.29：2.49:1:2.76; MVSHHN184LTTGATLINEQWLLTTAK在正常,肝炎,肝硬化,肝癌血清中的含量比例是6.73:2.47:1:3.19; VVLHPN241YSQVDIGLIK在正常,肝炎,肝硬化,肝癌血清中的含量比例是9.11：2.37：1：4.84。通过计算得到NLFLN207HSEN211ATAK上的位点占有率比例为1.13:1.10:1:0.97(N:HBV:LC: HCC); MVSHHN184LTTGATLINEQWLLTTAK上的位点占有率比例为1.05：1.08：1:1.12(N:HBV:LC:HCC); VVLHPN241YSQVDIGLIK上的位点占有率比例为1.42:1.04:1:1.70(N:HBV:LC:HCC)。按照相对糖基化位点占有率比值(Ratio)>1.5(上调)或Ratio<0.6(下调)为标准筛选,肝癌血清中VVLHPN241YSQVDIGLIK糖基化位点占有率相比肝硬化和肝炎明显上升,Ratio分别为1.70和1.63。研究表明,’iTRAQplus’18O’定量技术是一种创新、可行的糖蛋白研究策略。相比于肝硬化和肝炎,结合珠蛋白p亚基的Asn241糖基化位点占有率在肝癌血清中显著升高。第二部分肝病中血清Hp-β的总N-聚糖结构变化特征本部分研究旨在解析人血清中Hp-β的总N-聚糖结构。利用抗体亲和层析纯化血清Hp,SDS-PAGE分离Hp-p,采用PNGase F胶上酶切N-聚糖,以DHB为基质,使用MALDI-QIT-TOF MS/MS分析聚糖结构。并进行AAL凝集素印迹分析,验证肝病中血清Hp-β的N-聚糖结构变化。质谱结果发现,Hp-β主要含有两天线,三天线以及岩藻糖化的聚糖结构,相比于正常和肝炎血清,肝硬化和肝癌血清中的Hp-β的岩藻糖化聚糖含量明显升高。肝硬化和肝癌血清的Hp-p的AAL凝集素特异性结合能力比正常和肝炎高,有统计学差异,也说明在肝硬化和肝癌中Hp-β所含岩藻糖增多。研究表明,MALDI质谱在CID模式下产生的聚糖串联质谱图可以方便高效的获得聚糖结构信息。Hp-p的岩藻糖化聚糖变化可作为区分肝硬化肝癌患者(LC, HCC)和肝炎患者正常人(HBV, N)的潜在标志物,说明其在肝病过程中有着重要的诊断价值。第三部分肝病中血清Hp-β的单个糖基化位点N-聚糖结构变化本部分研究旨在解析人血清中Hp-p的单个糖基化位点的N-聚糖结构。利用抗体亲和层析纯化不同肝病血清中Hp, SDS-PAGE分离Hp-β,采用Trypsin酶解得到糖肽NLFLN207HSEN211ATAK, MVSHHN184LTTGATLINEQWLLTTAK和VVLHPN241YSQVDIGLIK。使用LC-ESI-HCD-MS/MS获得糖肽肽段序列和每条糖肽上含有的聚糖结构信息。质谱结果发现,Asn207和Asn211糖基化位点上有7种糖型,主要含有两天线,三天线以及岩藻糖化的聚糖结构。Asn184糖基化位点上有5种糖型,主要含有两天线,三天线以及岩藻糖化的聚糖结构。Asn241糖基化位点上有7种糖型,主要含有两天线,三天线,四天线以及岩藻糖化的聚糖结构。每条糖肽上的岩藻糖化聚糖结构在肝硬化和肝癌血清中均明显增多。研究表明,完整糖肽的分析,可以同时获得糖基化位点和对应的聚糖结构信息,有重要意义。Hp-β的3条糖肽上岩藻糖化聚糖变化可以区分肝硬化肝癌患者(LC, HCC)和肝炎患者正常人(HBV, N),确认了其作为聚糖分子标志物用于诊断的可能性。结论1.建立’iTRAQ plus18O’定量技术,并用于分析肝病中血清Hp-p四个糖基化位点占有率变化,发现Asn241糖基化位点占有率在肝癌血清中显著升高。2.分析肝病中血清Hp-p的总N-聚糖结构变化及单个糖基化位点上的聚糖结构变化,发现位于3条糖肽上的岩藻糖化聚糖结构在肝硬化和肝癌血清中均明显增多。3. Asn241糖基化位点占有率和岩藻糖化聚糖含量在肝癌患者血清中显著升高,表明Hp-p作为聚糖标志物诊断肝癌的潜在应用价值。潜在应用价值1.’iTRAQ plus18O’定量技术适用于多样本的目标糖蛋白糖基化位点占有率研究,对发现与疾病发生发展中相关的异常糖蛋白有重要价值。2.血清结合珠蛋白6亚基糖基化位点占有率和聚糖结构变化,可能成为肝病的聚糖标志物,丰富肝病诊疗指标的选择与组合。创新点1.首次建立了稳定高效的’iTRAQ plus18O’定量技术,为与疾病发生发展中相关的目标糖蛋白研究奠定了良好基础。2.系统详细的对肝病中血清结合珠蛋白β亚基的聚糖宏观(糖基化位点占有率)和微观不均一性(N-聚糖结构)进行研究,克服了以往传统技术上的一些弱点,对肝病患者的鉴别诊断有一定价值。