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帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种多发于中老年人的慢性神经系统退行性疾病,其特征性病理改变为黑质致密部多巴胺能神经元变性、坏死,继而引起纹状体多巴胺(dopamine, DA)含量降低。PD发病机制目前还不完全清楚,一般认为,可能与氧化应激、细胞凋亡和线粒体功能障碍等有关。因此,对神经元的保护和抗细胞凋亡等方面的治疗已成为现在PD治疗的主要思路。人参皂苷-Rg3(ginsenoside-Rg3,以下简称Rg3)为名贵中药人参的有效成分之一,其生物活性广泛,对多种原因如应激、缺血、缺氧所引起的神经细胞的损伤和凋亡有良好的保护作用。本课题组前期研究结果表明人参皂苷Rg3在体外能够抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡,并能减轻鱼藤酮纳米脂质载体(R-NLC)诱导的PD模型大鼠运动障碍,对黑质(SN) DA神经元凋亡有阻止作用。为进一步确证Rg3对DA能神经元的保护作用,并探讨其保护作用机制,本实验以R-NLC制备PD大鼠模型,应用行为学、透射电镜(TEM)技术、苏木素-伊红(HE)染色、氧化应激相关物质测定、蛋白免疫印迹法(Western blotting)等技术和方法,来探讨Rg3保护黑质DA能神经元的分子生物学机制。主要结果如下：1.人参皂苷-Rg3对PD模型大鼠黑质多巴胺能神经元的保护作用方法：分组：(1)对照组：ig0.5%CMC-Na+sc空白NLC；(2)模型组：ig0.5%CMC-Na+sc R-NLC;(3)(?)氐剂量药物组：igRg3(3mg/kg)+sc R-NLC;(4)中剂量药物组:igRg3(6mg/kg)+sc R-NLC;(5)高剂量药物组：igRg3(12mg/kg)+sc R-NLC;(6)阳性药物组：ig司来吉兰(11mg/kg)+sc R-NLC。大鼠皮下注射(sc) R-NLC,首剂量给予0.5mg/kg,第二次给予0.8mg/kg,此后1mg/kg/次,全程2天一次。其他药物每天给药一次,连续28天。采用肌僵直实验和评分法考察外观行为学表现；黑质HE染色和透射电镜观察神经细胞形态和细胞超微结构情况。结果：(1)外观行为学评分：大鼠的行为学表现随给药时间延长而加重,给药28天后,模型组行为学评分5.43±0.79,比对照组明显增高(P<0.05)。Rg3低、中、高剂量干预后,行为学评分分别为1.00±0.58、1.50±0.83、0.0±0.0,比模型组评分明显减少(P<0.05),各组在整个给药过程中均未出现严重的行为学表现。肌僵直实验中,模型组大鼠肢体移动潜伏期为14.17±0.83s,比对照组明显延长(P<0.05),Rg3低、中、高剂量组移动潜伏期分别为2.53±0.09s、3.35±0.41s、2.07±0.22s,比模型组明显缩短(P<0.05)。(2)HE染色观察黑质DA能神经元形态：与对照组相比,模型组大鼠黑质正常神经元数目减少,神经元形态不完整,尼氏体减少,细胞核略有变化,细胞内物质出现边集现象,有的出现嗜酸性细胞,符合早期细胞凋亡的特征。Rg3干预能避免模型大鼠黑质神经元形态的变化,减少尼氏体的消失,减少细胞凋亡的产生,使存活的神经元数目增多。(3)透射电镜观察黑质细胞超微结构：与对照组相比,模型组大鼠黑质神经元细胞稍有皱缩,细胞体积变小,细胞核膜边界不清晰,少见膜间隙,核膜上少见核糖体,核仁体积变小,染色质凝聚成块并有边聚倾向,胞浆体积变小,细胞质中细胞器数量减少,内质网上核糖体数量减少,线粒体出现嵴部分溶解现象,线粒体和内质网出现肿胀、扩张现象,有空泡产生,与细胞凋亡的特征一致。经过低、中、高剂量Rg3干预,与模型组相比,大鼠黑质神经元细胞的超微结构基本正常,少见细胞皱缩,细胞核膜清晰,核仁大而圆,细胞质中可见正常完整的细胞器,未见细胞凋亡发生,与对照组细胞形态接近,其中Rg3高剂量组及司来吉兰组干预作用更加明显,未见结构异常细胞。结论：Rg3对R-NLC诱导的黑质DA能神经元损伤有保护作用,可减少或阻断神经细胞的凋亡。2.人参皂苷-Rg3对PD模型大鼠黑质DA能神经元氧化应激的影响方法：同上分组和造模。大鼠于末次注射药物后24h,取黑质制成10%组织匀浆液,分别采用黄嘌呤氧化酶法和二硫代二硝基苯甲酸法测定组织中SOD、GSH-PX活力,应用硫代巴比妥缩合法测定MDA含量。结果：(1)对MDA含量的影响：模型组黑质中MDA含量由对照组的2.51±0.15(nmol/mgprot)升高到4.22±0.37(nmol/mgprot)(P<0.01). Rg3低、中、高剂量组MDA含量较模型组明显降低,分别为2.92±0.08(nmol/mgprot)、2.90±0.14(nmol/mgprot)、2.80±0.73(nmol/mgprot)(P<0.01)。(2)对SOD活力的影响：模型组黑质中SOD活力35.34±3.20(U/mgprot)较对照组51.85±3.15(U/mgprot)显著下降(P<0.01)。低、中、高剂量Rg3干预后其SOD活力较模型组显著升高,分别为45.70±3.11(U/mgprot)、43.99±4.76(U/mgprot)、47.37±1.18(U/mgprot)(P<0.01).(3)对GSH-PX活力的影响：模型组黑质中GSH-PX活力18.89±1.99(U/mgprot)较对照组38.78±2.01(U/mgprot)显著下降(P<0.01)。低、中、高剂量Rg3干预后其GSH-PX活力较模型组显著升高,分别为28.42±0.69(U/mgprot)、31.49±1.47(U/mgprot)、34.03±1.57(U/mgprot)(P<0101)。结论：Rg3具有明显的抗氧化作用,可能通过抗氧化作用来保护神经元细胞。3.人参皂苷-Rg3对PD模型大鼠黑质DA能神经元凋亡相关Caspase家族及Bcl-2家族的影响方法：同上分组和造模。大鼠于末次注射药物后24h,取黑质制成组织裂解物。应用Western blot法测定Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9及Bcl-2、Bax蛋白表达。结果：(1)对Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活化的影响：Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9受到某些因素影响而由前体产生有酶活性的片段,此过程为Caspase的活化。与对照组相比,模型组黑质神经元中Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9的活化水平同时显著增强,而用一定剂量Rg3预处理后细胞中Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9活化程度降低,提示Rg3抗黑质DA能神经元凋亡的作用机制可能涉及对凋亡关键蛋白水解酶Caspase-3及其上游Caspase-8和Caspase-9(?)舌化水平的调节。(2)对Bcl-2及Bax表达的影响：与对照组相比,模型组黑质神经元中Bax蛋白表达水平增加,而Bcl-2蛋白表达水平降低,Bcl-2/Bax的比值显著降低；与模型组相比,Rg3干预组大鼠黑质神经元Bcl-2蛋白表达水平均有显著回升,而Bax蛋白表达水平明显降低,Bcl-2/Bax的比值呈显著升高。结论：Rg3可能通过对凋亡关键蛋白水解酶Caspase-3及其上游Caspase-8活化的调节以及增加Bcl-2的表达和减少Bax的表达来发挥抗黑质DA能神经元凋亡作用。