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哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)是一种在土壤中广泛存在的好氧的革兰氏阴性菌，属于拟杆菌门(Bacteroidetes)，它没有游离纤维素酶系和纤维小体结构，采用一种全新且未知的方式高效降解纤维素。此外，C.hutchinsonii不依赖于鞭毛或纤毛却能在固体介质表面滑动，其运动机制尚不清楚。
Ⅸ型分泌系统(T9SS)在拟杆菌门细菌中广泛存在且仅存在于拟杆菌门中。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)T9SS对底物蛋白的分泌机制研究得最为清楚。具有C端保守结构域(C-terminal conserved domain，CTD)的蛋白质(包括其主要毒力因子半胱氨酸蛋白酶)在P.gingivalis细胞质中合成并通过T9SS分泌到细胞表面，然后通过与阴离子脂多糖(anionic lipopolysaccharide，A-LPS)相连而锚定于细胞表面。T9SS和A-LPS对P.gingivalis的致病性至关重要。C.hutchinsonii有T9SS的全部同源蛋白，前期研究发现T9SS核心组分在纤维素降解和滑动中发挥着重要的作用，并且T9SS分泌的许多CTD蛋白在菌体的纤维素降解中起关键作用，但C.hutchinsonii是否存在A-LPS以及T9SS分泌的CTD蛋白的锚定机制仍不清楚。
本文通过转座子插入突变的方法得到一万多个转化子，通过在铺有滤纸的平板上筛选到滤纸降解缺陷株54个，利用反向PCR技术鉴定插入位点，随后进行生物信息学分析并选择32个基因进行单敲除，发现其中5个基因与LPS的合成相关，进一步研究了这5个基因的具体功能，并探讨了LPS合成影响纤维素降解的机制。具体研究内容如下:
C.hutchinsonii的chu_2177、chu_2178的功能研究:根据NCBI功能注释，预测chu_2177编码O-抗原连接酶，其下游基因chu_2176编码O-抗原或壁磷酸的转运蛋白，上游基因chu_2178编码一个未知功能蛋白。C.hutchinsonii还存在一个预测编码O-抗原连接酶的chu_0602。通过生物信息学分析及各个菌株的LPS银染图，证实chu_2176编码O-抗原翻转酶，chu_2177编码O-抗原聚合酶，chu_2178编码O抗原链长决定蛋白，chu_0602编码O-抗原连接酶，这些基因都参与LPS的合成，并且C.hutchinsonii只产生一种LPS。此外，△2177、△2178均不能降解滤纸和结晶纤维素且菌体滑动缺陷，缺陷菌株对纤维素吸附能力显著降低、胞外多糖减少、生物膜形成出现障碍以及抗逆性下降。
C.hutchinsonii的纤维素酶主要位于细胞外膜，而△2177和△2178的外膜中纤维素酶活显著降低，胞外纤维素酶活则增加，推测纤维素酶在突变株的外膜锚定失败而游离到了胞外。提取WT、△2177和△2178的外膜和胞外蛋白并进行质谱鉴定，发现△2177和△2178外膜CTD蛋白减少约60％，胞外CTD蛋白则显著增加。外膜减少的CTD蛋白为A型CTD蛋白，包括影响纤维素降解的外膜蛋白CHU_0922，3个内切纤维素酶和7个糖苷水解酶家族蛋白。这表明C.hutchinsonii的A型CTD蛋白可能是通过LPS锚定于外膜的。于是我们利用A型CTD蛋白内切纤维素酶CHU_1336的抗体对CHU_1336定位，发现在野生型中定位于外膜的CHU_1336在△2177和△2178的外膜并未检测到，反而出现在胞外基质中，证明LPS的缺陷会影响包括纤维素酶在内的一些△型CTD蛋白在外膜的锚定。
研究还发现突变株外膜中一些不含CTD的蛋白的表观分子量比野生型的小，推测这些外膜蛋白可能存在LPS修饰。提取WT的LPS并测定其单糖成分，发现可能存在甘露糖、核糖、半乳糖醛酸和岩藻糖成分。我们用能识别岩藻糖基化蛋白的凝集素AAL对WT、△2177和△2178的外膜蛋白进行检测，发现WT有大量岩藻糖基化蛋白，而△2177和△2178的外膜中未检测到糖蛋白，进一步表明这些蛋白可能存在LPS修饰。C.hutchinsonii中非CTD蛋白的LPS糖基化修饰机制还有待进一步研究。我们推测LPS的O-抗原寡糖链合成并翻转到周质空间后，除了参与LPS的合成，还可能通过寡糖基转移酶将其转移到蛋白上形成糖基化蛋白。
综上，我们发现C.hutchinsonii仅存在一种LPS，LPS缺陷通过影响外膜非CTD蛋白的LPS糖基化修饰和CTD蛋白在细胞表面的锚定使菌体的纤维素酶活和纤维素吸附能力下降，从而影响纤维素降解。
C.hutchinsonii的chu_1927、chu_2532、chu_3392的功能研究:通过生物信息学分析，预测chu_1927编码合成O-抗原的起始酶，chu_2532编码合成O-抗原的糖基转移酶，chu_3392编码合成O-抗原糖前体的脱氢酶。chu_1927、chu_2532和chu_3392的单独敲除使菌体的LPS的O抗原缺失，说明chu_1927、chu_2532和chu_3392参与O-抗原的合成，并进一步证实C.hutchinsonii只产生一种LPS。△1927、△2532、△3392不能降解滤纸和结晶纤维素且菌体滑动缺陷。此外，还发现缺陷菌株的纤维素酶活降低、外膜蛋白的表观分子量比野生型的小、对纤维素吸附能力显著降低、胞外多糖减少以及生物膜形成出现障碍。
本文发现C.hutchinsonii的LPS缺陷影响了纤维素的降解，并对其机制进行了探讨，这将为进一步阐明C.hutchinsonii独特的纤维素降解机制提供有力帮助，也将推动对纤维素资源的高效利用。
Ⅸ型分泌系统(T9SS)在拟杆菌门细菌中广泛存在且仅存在于拟杆菌门中。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)T9SS对底物蛋白的分泌机制研究得最为清楚。具有C端保守结构域(C-terminal conserved domain，CTD)的蛋白质(包括其主要毒力因子半胱氨酸蛋白酶)在P.gingivalis细胞质中合成并通过T9SS分泌到细胞表面，然后通过与阴离子脂多糖(anionic lipopolysaccharide，A-LPS)相连而锚定于细胞表面。T9SS和A-LPS对P.gingivalis的致病性至关重要。C.hutchinsonii有T9SS的全部同源蛋白，前期研究发现T9SS核心组分在纤维素降解和滑动中发挥着重要的作用，并且T9SS分泌的许多CTD蛋白在菌体的纤维素降解中起关键作用，但C.hutchinsonii是否存在A-LPS以及T9SS分泌的CTD蛋白的锚定机制仍不清楚。
本文通过转座子插入突变的方法得到一万多个转化子，通过在铺有滤纸的平板上筛选到滤纸降解缺陷株54个，利用反向PCR技术鉴定插入位点，随后进行生物信息学分析并选择32个基因进行单敲除，发现其中5个基因与LPS的合成相关，进一步研究了这5个基因的具体功能，并探讨了LPS合成影响纤维素降解的机制。具体研究内容如下:
C.hutchinsonii的chu_2177、chu_2178的功能研究:根据NCBI功能注释，预测chu_2177编码O-抗原连接酶，其下游基因chu_2176编码O-抗原或壁磷酸的转运蛋白，上游基因chu_2178编码一个未知功能蛋白。C.hutchinsonii还存在一个预测编码O-抗原连接酶的chu_0602。通过生物信息学分析及各个菌株的LPS银染图，证实chu_2176编码O-抗原翻转酶，chu_2177编码O-抗原聚合酶，chu_2178编码O抗原链长决定蛋白，chu_0602编码O-抗原连接酶，这些基因都参与LPS的合成，并且C.hutchinsonii只产生一种LPS。此外，△2177、△2178均不能降解滤纸和结晶纤维素且菌体滑动缺陷，缺陷菌株对纤维素吸附能力显著降低、胞外多糖减少、生物膜形成出现障碍以及抗逆性下降。
C.hutchinsonii的纤维素酶主要位于细胞外膜，而△2177和△2178的外膜中纤维素酶活显著降低，胞外纤维素酶活则增加，推测纤维素酶在突变株的外膜锚定失败而游离到了胞外。提取WT、△2177和△2178的外膜和胞外蛋白并进行质谱鉴定，发现△2177和△2178外膜CTD蛋白减少约60％，胞外CTD蛋白则显著增加。外膜减少的CTD蛋白为A型CTD蛋白，包括影响纤维素降解的外膜蛋白CHU_0922，3个内切纤维素酶和7个糖苷水解酶家族蛋白。这表明C.hutchinsonii的A型CTD蛋白可能是通过LPS锚定于外膜的。于是我们利用A型CTD蛋白内切纤维素酶CHU_1336的抗体对CHU_1336定位，发现在野生型中定位于外膜的CHU_1336在△2177和△2178的外膜并未检测到，反而出现在胞外基质中，证明LPS的缺陷会影响包括纤维素酶在内的一些△型CTD蛋白在外膜的锚定。
研究还发现突变株外膜中一些不含CTD的蛋白的表观分子量比野生型的小，推测这些外膜蛋白可能存在LPS修饰。提取WT的LPS并测定其单糖成分，发现可能存在甘露糖、核糖、半乳糖醛酸和岩藻糖成分。我们用能识别岩藻糖基化蛋白的凝集素AAL对WT、△2177和△2178的外膜蛋白进行检测，发现WT有大量岩藻糖基化蛋白，而△2177和△2178的外膜中未检测到糖蛋白，进一步表明这些蛋白可能存在LPS修饰。C.hutchinsonii中非CTD蛋白的LPS糖基化修饰机制还有待进一步研究。我们推测LPS的O-抗原寡糖链合成并翻转到周质空间后，除了参与LPS的合成，还可能通过寡糖基转移酶将其转移到蛋白上形成糖基化蛋白。
综上，我们发现C.hutchinsonii仅存在一种LPS，LPS缺陷通过影响外膜非CTD蛋白的LPS糖基化修饰和CTD蛋白在细胞表面的锚定使菌体的纤维素酶活和纤维素吸附能力下降，从而影响纤维素降解。
C.hutchinsonii的chu_1927、chu_2532、chu_3392的功能研究:通过生物信息学分析，预测chu_1927编码合成O-抗原的起始酶，chu_2532编码合成O-抗原的糖基转移酶，chu_3392编码合成O-抗原糖前体的脱氢酶。chu_1927、chu_2532和chu_3392的单独敲除使菌体的LPS的O抗原缺失，说明chu_1927、chu_2532和chu_3392参与O-抗原的合成，并进一步证实C.hutchinsonii只产生一种LPS。△1927、△2532、△3392不能降解滤纸和结晶纤维素且菌体滑动缺陷。此外，还发现缺陷菌株的纤维素酶活降低、外膜蛋白的表观分子量比野生型的小、对纤维素吸附能力显著降低、胞外多糖减少以及生物膜形成出现障碍。
本文发现C.hutchinsonii的LPS缺陷影响了纤维素的降解，并对其机制进行了探讨，这将为进一步阐明C.hutchinsonii独特的纤维素降解机制提供有力帮助，也将推动对纤维素资源的高效利用。