乳腺癌是目前女性最常见的致死性恶性肿瘤之一,近年来,随着人们生活和工作方式的改变,我国乳腺癌发病率快速上升,已经成为严重影响我国女性生存和生活质量的一个公共健康问题。鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase, ODC)是多胺合成过程中第一个也是最重要的限速酶,在许多人类恶性肿瘤组织包括乳腺癌组织中高度表达。MYC与Max形成复合物结合于E-box (CACGTG)时,即可激活ODC的表达；而当Max与MYC的拮抗蛋白MAD家族成员(包括Mnt、MAD1、MXI1及MAD4等)形成复合物结合于E-box时,即可抑制ODC的表达。这提示MYC蛋白、MXI1蛋白以及ODC之间可能存在一定的关系。目前关于ODC G316A位点多态性与乳腺癌预后的关系,以及此位点在乳腺癌预后中的作用尚不清楚,同时DFMO抑制ODC的合成是否与此位点的多态性相关也知之甚少。因此,本研究通过探讨 ODC G316A基因多态性在乳腺癌发生发展及预后中的作用,旨在为验证此多态性位点能否成为乳腺癌预后新的遗传学标记物奠定基础。分析MXI1蛋白、C-MYC蛋白表达及ODC G316A位点与乳腺癌患者生存关系；研究MXI1蛋白、C-MYC蛋白表达与ODC G316A多态性关系,并且研究药物DFMO对乳腺癌细胞系发挥作用与ODC G316A多态性的关系。方法1.MXI1蛋白、C-MYC蛋白表达及ODC G316A位点与乳腺癌患者生存关系：通过免疫组化检测乳腺癌标本中MXIl和C-MYC蛋白表达,利用巢式PCR及毛细管电泳(PCR-RFLP)方法对乳腺癌标本进行ODC G316A位点的分型；采用Kaplan-Meier法对C-MYC蛋白、MXIl蛋白表达状况和ODC G316A位点不同基因型与乳腺癌患者的生存时间进行分析；2.MXI1蛋白、C-MYC蛋白表达与ODC G316A多态性关系：在乳腺癌细胞系MCF-7中转染MXI1-shRNA Plasmid重组质粒,并筛选得到MXIl稳定敲底的细胞系MCF-7-shMXIl，通过实时定量PCR和Western blot方法分别在mRNA和蛋白水平上确认MXIl基因敲底效果。利用基于1aqman探针的RT-PCR方法检测MXIl基因敲底后的ODC G316A等位基因的变化；采用染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)方法研究C-MYC蛋白和MXIl蛋白对ODC G316A等位基因的亲和性；3. DFMO对乳腺癌细胞系的作用与ODC G316A多态性的关系：利用MTT(噻唑兰)比色法检测不同浓度的DFMO对MDA-435细胞和SK-br3细胞的增殖抑制作用,流式细胞术检测不同浓度的DFMO对两种细胞的凋亡和周期影响。结果1.MXI1蛋白、C-MYC蛋白表达与乳腺癌患者生存时间的关系：300例确诊的乳腺癌患者中有92(30.67%)例患者MYC高表达,而208(69.33%)例患者MYC低表达(其中有65例中等染色,103例低染色,40例无染色)；而对于MXI1,有71(23.67%)例患者高表达,229(76.33%)例患者低表达(其中有78例中等染色,109例低染色,42例无染色)。对于C-MYC蛋白来说,C-MYC高表达组(high expression group, C-MYC-HEG)的乳腺癌患者较C-MYC低表达组(low expression group, C-MYC-LEG)的患者具有更短的生存时间,差异具有统计学意义(x2=16.003,P=-0.000)；而对于MXIl蛋白,MXIl低表达组(low expression group, MXI1-LEG)的乳腺癌患者较MXIl高表达组(high expression group, MXI1-HEG)组的患者具有更短的生存时间,差异具有统计学意义(x2=7.266,P=0.007)。2. ODC G316A位点多态性与乳腺癌患者生存时间分析：在分析时300例乳腺癌患者有168例(56%)患者去世,其中ODC GG组患者72例(42.86%),ODC AA/AG组患者96例(57.14%)。进一步的数据分析显示,ODC GG组患者的10年生存率为53.85%,而对于ODC AA/AG组的10年生存率仅为33.33%,差异具有统计学意义(x2=15.812,P=0.000)。进一步对患者的分期与ODC G316A分型之间的关系亦进行了统计学分析,结果显示：对于I期乳腺癌患者ODC GG组和ODC AA/AG组患者生存时间无明显差异(x2=0.021,P=0.884)：对于Ⅱ期乳腺癌患者ODC GG组和ODC AA/AG组患者生存时间亦无明显差异(x2=0.423,P=0.5125)。而对于Ⅲ期乳腺癌患者,ODC GG组患者的中位生存时间为9年2个月(10年生存率为44.23%),ODC AA/AG;组患者的中位生存时间为8年5个月(10年生存率为24%),两组间生存率差异有统计学意义(x2=5.464,P=0.019)。3.MXI1蛋白、C-MYC蛋白表达与ODC G316A多态性关系：C-MYC蛋白和MXIl蛋白表达高低与ODC G316A的多态性有关：C-MYC蛋白在ODC AA/AG组的高表达率明显高于ODC GG组(x2=17.812,P=0.000)；而MXIl蛋白在ODC AA/AG组的低表达率也高于ODC GG组(x2=5.524,P=0.019)。MXI1基因沉默对ODC基因和蛋白的表达无明显影响,但是ODC G316A等位基因A/G表达量却发生了变化,A较G的表达量明显上升。而且Western blot结果显示,C-MYC蛋白和MXIl蛋白在乳腺癌的MDA-435细胞系和MCF-7细胞系中均有表达。染色质免疫沉淀结果显示,C-MYC蛋白和MXI1蛋白均选择性地结合于ODC G316A的等位基因A。4. DFMO对乳腺癌细胞系的作用与ODC G316A多态性的关系：DFMO对乳腺癌细胞系SK-br3(ODC AA)的增殖抑制作用强于对MDA-435(ODC GG)细胞系的作用：10mmol/l及20mmol/l的DFMO对MDA-435和SK-br3作用48小时的生长抑制率分别为24.1%和33.6%、46.3%和53.5%,且OD值差异均具有统计学意义(t=2.134,P=0.021；t=2.213,P=0.019)；10mmol/l及20mmol/l的DFMO对MDA.-435和SK-br3作用72小时的生长抑制率分别为28.9%和35.7%、54.3%和65.4%,且OD值差异均具有统计学意义(t=2.434,P=0.015；t=2.489,P=0.013)；当DFMO的浓度是20mmol/l时,检测24h、48h、72h时MDA-435 (ODC GG)和SK-br3 (ODC AA)细胞系的凋亡率,分别为7.58%±2.06% VS 13.88%±3.45%(t=2.047,P＝0.041)、43.28%±14.28%VS 59.96%±16.42%(t=3.680,P=0.000)和77.87%±30.25%VS93.08%±32.15%(t＝3.293,P=0.0001),差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测细胞周期,当DFMO的浓度是20mmol/l时,测得MDA-435(ODC GG)细胞系和SK-br3(ODC AA)细胞系在培养24h、48h、72h后S期细胞所占比例分别为13.25%±2.38%VS12.89%±2.21%,21.43%±3.12%VS12.24%±3.55%,16.32%±3.23%VS15.24±3.01%,对这三组数据分别进行统计检验,测得48小时的S期细胞,MDA-435(ODC GG)细胞系明显高于SK-br3(ODC AA)细胞系,差异具有统计学意义(t=2.638,P=0.012)。进一步检测经DFMO处理的乳腺癌细胞系MCF-7的ODC G316A等位基因A/G表达量,结果显示ODC G316A等位基因A的表达量降低(t=3.708,P=0.000),而G的表达量无明显变化。结论1. C-MYC蛋白的高表达和MXI1蛋白的低表达可以作为乳腺癌患者预后不良因素,对于ODC G316A多态性,ODC AA/AG基因型乳腺癌患者预后比ODCGG基因型患者预后更差。ODC G316A基因多态性可望成为乳腺癌的一种新的遗传学标记物。2.MXI1在乳腺癌的发生发展中可能和ODC G316A的等位基因A结合从而起到调节作用。3. DFMO对不同ODC G316A遗传学类型的乳腺癌细胞系增殖、凋亡和细胞周期的影响不同；推测此种作用的可能潜在机制是DFMO选择性地结合于ODC G316A的等位基因A,尚需要进一步功能分析。