大劣按蚊和中华按蚊是我国重要的疟疾病媒。中华按蚊因其分布广、密度高,目前仍被认为是间日疟的主要媒介。大劣按蚊是山区地区重要的媒介,历史上是重要的恶性疟传播媒介。microRNA(miRNA)作为一种调节性非编码小分子RNA,其大小约为22nt,不仅存在于动植物,而且存在于病毒、细菌、真菌,它通过与靶mRNA 3’端非翻译区结合导致mRNA降解或翻译抑制,从转录后水平调控基因的表达,在胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡及细胞分化、代谢、免疫调节等多方面起着重要作用。目的:比较评估两种主要的miRNA鉴定方法,为后续研究提供方法学依据。明确中华按蚊各发育期miRNA表达谱,初步了解miRNA在蚊媒生长发育过程的作用;鉴定重要的发育相关的miRNA分子揭示大劣按蚊、中华按蚊在感染疟原虫前后转录组及miRNA的变化;鉴定易感性相关的miRNA分子,为进一步开展媒介-疟原虫相互作用的分子机制的深入研究提供新的角度和理论基础。方法:本研究分为三个部分。第一部分,本论文首先比较研究了高通量测序和生物信息学两种方法在预测我国主要传疟媒介中华按蚊miRNA表达谱的差异并对结果进行分析比较,第二部分,主要以我国主要传疟媒介大劣按蚊及中华按蚊为研究对象,在实验室条件下,通过收集中华按蚊不同发育阶段样本,研究中华按蚊miRNA表达谱及其在发育过程中的功能;第三部分,对大劣按蚊在感染伯氏疟原虫d1后以及对中华按蚊吸食含有伯氏疟原虫小鼠血液和正常小鼠血液d1后miRNA和转录组采用高通量深度测序进行联合分析,探索miRNA其在不同按蚊感染疟原虫易感性调控的相关功能,以进一步了解按蚊传播疟原虫的机制。结果:第一部分:生物信息预测以及深度测序的方法是目前用于鉴定miRNA的两种最主要的研究方法。本部分研究通过采用高通量测序和生物信息学两种方法对中华按蚊成蚊miRNA预测分析中进行比较研究。研究发现,通过高通量测序技术可在中华按蚊中共确定了 49个保守的miRNAs和12个新的miRNAs。相比之下,生物信息学方法能够预测43个miRNAs,其中两个被认为是新的miRNAs。通过两种方法对miRNA表达谱进行对比分析,发现它们之间共享21个miRNA。另外,12种新的miRNA与其它物种的已知miRNA均不具有同源性,表明它们可能是物种特异性的。在许多蚊媒种类中发现均有40个miRNAs,这表明这些miRNAs在进化上是保守的,而且在生命的过程中可能具有重要的作用。在测序样本中,通过定量实时PCR(qRT-PCR),可以检测出已知和新的miRNA(asi-miR-281,asi-miR-184,asi-miR-14,asi-miR-nov5,asi-miR-nov4,asi-miR-9383,asi-miR-2a),qRT-PCR检测的这些miRNAs的表达模式与原始miRNA测序数据一致。已知和新的miRNAs的预测靶基因涵盖了许多重要的生物学作用和途径,表明miRNA功能的多样性。此外,基于对冈比亚按蚊的信息,我们还发现了 21个保守的miRNA和8个目标免疫通路基因。第二部分:通过对中华按蚊4个不同发育时期miRNA表达谱进行研究,总计从10746万原始测序数据中鉴定164个miRNAs。其中99个被确认为已知的miRNAs,其余的65个miRNAs被认为是新的。通过对所有发育阶段miRNAs的读序进行分析,共发现95个miRNAs在连续的发育阶段中显示阶段性特异表达(q值<0.01&|log2(fold change)|>1),表明这些miRNAs可能参与了发育过程中关键的生理活动。在四个发育阶段,有16个miRNAs在各相邻期均有差异表达。许多miRNAs表现出了阶段特异性的表达,如asi-miR-2943在卵期完全表达,在幼虫期不能检测到asi-miR-1891。经qRT-PCR鉴定的6种差异表达的miRNAs与测序结果一致。此外,通过结合miRanda和RNAhybrid软件对靶基因进行预测,分别对68种已知和27种新miRNAs预测到5296和1902靶基因。GO注释和KEGG通路分析差异表达的miRNAs靶基因显示它们可能参与广泛的生物学过程,如膜结构、有机物质运输和几个关键通路包括蛋白质在内质网处理,丙酸叶酸代谢和生物合成。此外,通过miRNAs-基因网络分析鉴定了 32个发育过程关键的miRNAs。第三部分:前期研究表明不同按蚊对疟原虫的易感性存在差异。同时,病原体已经进化出多种逃避机制进而在蚊体内建立感染。然而有关这些差异及事件的具体分子机制目前仍然不清楚。本部分通过研究我国两种不同传疟按蚊在感染病原体前后转录组和miRNA组所产生变化,来分析确认与易感性相关的一些关键的调控因子及其靶基因。研究发现中华按蚊在吸食正常小鼠血液和感染疟原虫的小鼠血液后筛选到的差异基因为29个,在中华按蚊共发现110个已知miRNA,以及50个新miRNA。对两组间差异miRNA进行比较,发现9个miRNA出现下调。对大劣按蚊感染伯氏疟原虫组(1dpi)和吸食正常血液组的转录组数据发现差异基因为671个,对大劣按蚊miRNA组进行分析共发现103个已知miRNA及49个新miRNA。比较两组差异发现20个已知miRNA存在差异表达(6个miRNA下调,14个miRNA上调),8个新miRNA出现差异表达(5个miRNA下调,3个miRNA上调)。GO和KEGG富集分析显示在大劣按蚊感染前后转录组差异GO 分类中富集程度较高的是“monooxygenase activity”,“tetrapyrrole binding”以及“transporter activity”,而 miRNA 组差异 GO 分类中富集程度较高的是“ion binding”,“nucleoside phosphate binding”以及“catalytic activity”;对差异基因的KEGG富集结果发现差异基因在Signaling molecules and interaction,Metabolism of cofactors and vitamins和Substance dependenc等通路中。对差异miRNA的KEGG富集结果发现其在 Endocrine system,Immune system 和 Lipid metabolism 等通路中分别上调和下调。此外,在中华按蚊及大劣按蚊转录组分析中均发现一定数量的可变剪切事件及SNP位点,这也有可能贡献于决定按蚊易感性的免疫反应调控。此外,在确定了 miR-2944a-5p的二级结构以及与TSL的靶向关系基础上,联合转录组分析发现miR-2944a-5p靶基因ADIR006646在感染前后发生1.4倍上调。通过对大劣按蚊miR-2944a-5p靶基因ADIR006646进行同源分析,发现其为冈比亚按蚊AGAP002282同源基因,该基因为MAPK信号通路中的torso-like(TSL)基因。研究推断miR-2944a-5p可能是重要的易感性相关miRNA,并通过靶向相关基因及通路影响按蚊对疟原虫的易感性。研究小结:有关我国传疟媒介的研究,虽然在形态学、生态学、群体遗传学等方面已经取得一些进展,但它们是否能够成为有效的恶性疟传播媒介并引起疟疾流行,从流行病学和分子生物学上都缺乏相关证据。此外,我国按蚊对不同疟原虫的感染率比较研究显示存在较大差异,部分研究结果尚存在较大分歧。在上述背景下,通过实验研究我国重要传疟媒介大劣按蚊、中华按蚊对不同疟原虫易感性将有利于揭示按蚊感染后的表达调控系统及发生机理,分析不同按蚊对不同疟原虫易感性中miRNA表达谱的差异,筛选并鉴定与疟原虫感染相关miRNA,并进一步研究其功能和作用机制,将有助于从转录后水平上揭示媒介-疟原虫相互作用的分子机制,阐明大劣按蚊、中华按蚊对不同疟原虫易感性分子机理,从而为媒介控制策略和疟疾防治提供新的思路。在消除疟疾的背景下,了解中华按蚊生物学及生态习性对减少疟疾传播和消除疟疾均是至关重要。了解miRNA在蚊媒生长发育过程各期差异表达对于了解其在变态发育过程、吸血和疾病传播中的作用具有重要意义。研究媒介与病原体相互作用需要更多的研究投入,特别是有关其易感性的研究对于输入性疟疾特别是边境地区疟疾防控至关重要。创新点:1.采用两种研究方法对我国主要传疟媒介按蚊中华按蚊miRNA表达谱进行了比较研究,并对各自的优缺点进行了分析讨论。2.全面分析了中华按蚊各发育期的miRNA表达特征,并对发育相关基因进行靶向分析,发现32个参与发育调控的miRNA以及部分重要的发育基因及发育信号通路。3.在中华按蚊和大劣按蚊在对伯氏疟的易感性表型上存在差异基础上,分析了感染伯氏疟原虫后mRNA和miRNA表达谱的表达变化进行分析,初步筛选获得参与调控按蚊对疟原虫易感性的关键miRNA,为深入研究miRNA调控易感性的分子机制奠定基础。